布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，包括复溶液管和预装检测试剂的扩增检测管、样品采集管、定量吸管、一次性手套以及滴加1μL阳性质粒pMD18

【技术实现步骤摘要】
布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及细菌检测
，具体为布鲁氏菌病疫苗株与野毒株现场快速鉴别诊断试剂盒及使用方法。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患传染病，以发热和流产为主要特征，流行于170多个国家和地区，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁，我国将其列为二类动物疫病。近年来，随着我国家畜饲养量的增加，我国人间和畜间布病发病数均呈快速上升趋势。
[0003]布病的防控坚持免疫预防为主的策略，但现有的A19、S2、RB51等弱毒疫苗各有优缺点，且疫苗免疫会干扰后期实验室诊断，无法区分疫苗免疫和野毒感染，给养殖场的布病防控和净化带来很大麻烦，在此形势下新的基因缺失标记疫苗应运而生。由天康生物股份有限公司、新疆畜牧科学院兽医研究所联合研发的新型基因标记疫苗——布鲁氏菌病活疫苗(A19
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ΔVirB12株)，商品名康布净，已获得农业农村部颁发的新兽药证书，标志着布病防治取得突破性进展。牛布鲁氏菌病A19
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ΔVirB12活疫苗是以A19株为亲本株，缺失布鲁氏菌IV型分泌系统中VirB12基因的基因缺失疫苗。根据其缺失的VirB12基因设计引物，扩增缺失基因的一部分或全部片段，能有效扩增的为布鲁氏菌野毒株，不能扩增的为基因缺失疫苗株，便可有效区分疫苗免疫和野毒感染，在只免疫A19
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ΔVirB12活疫苗的养殖场检测出布病野毒感染动物，以控制和净化养殖场中存在的布病野毒，减少布病带来的经济损失，保障人员安全。因此根据A19
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ΔVirB12活疫苗缺失的VirB12基因建立快速、特异、适合布病基层防控的鉴别诊断方法对布鲁氏菌病的防控至关重要。
[0004]根据动物布鲁氏菌病诊断技术国家标准(GB/T 18646
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2018)，可用于布鲁氏菌诊断的技术方法有：虎红平板凝集试验和间接酶联免疫吸附试验，适用于动物布鲁氏菌病的初筛；乳牛全乳环状试验，适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛；试管凝集试验、补体结合试验和竞争酶联免疫吸附试验适用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌病的血清学确诊；病原的鉴定和PCR适用于动物布鲁氏菌病的病原学确诊。近年来，基于PCR的病原检测方法研究和应用较为广泛，然而，在实际应用中，还存在一定不足：(1)布鲁氏菌DNA的制备耗时费力，详见国标GB/T 18646
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2018“4.13.1”；(2)检测流程复杂需要专业人员操作；(3)存在非特异性扩增和灵敏度低的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，解决现有技术PCR的病原检测过程中存在的布鲁氏菌DNA的制备耗时费力、检测流程复杂、需要专业人员操作及非特异性扩增和灵敏度低的问题。
[0006]本申请根据A19
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ΔVirB12活疫苗缺失的VirB12基因实现区分疫苗免疫和野毒感
染，实现从生鲜乳中一步扩增目标基因的目的。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，包括如表1所示的组分：
[0008]表1布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分
[0009]编号名称数量备注1样品采集管6个常温保存2阳性膜片1管常温保存3阴性膜片1管常温保存4扩增检测管1个塑封包装、常温保存5复溶液1管常温保存620μL定量吸管1个常温保存72μL定量吸管8个常温保存8一次性手套1双常温保存9说明书1份常温保存
[0010]进一步的，所述扩增检测管为8连排检测管，所述扩增检测管预装检测试剂和冻干保护剂，其中，检测试剂为：5G聚合酶、UNG酶、10
×
qPCR buffer以及如表2所示的布鲁氏菌VirB12基因的特异性引物和Taqman探针，所述10
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qPCR buffer内含浓度为0.4mM dA/C/GTP、0.8mM dUTP和8mM MgSO4；冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.10
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0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为 0.01
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0.02g/mL；
[0011]表2布鲁氏菌VirB12基因的特异性引物序列和Taqman探针
[0012][0013]进一步的，所述阳性膜片为经FTA Elute Cards,Whatman滴加1μL阳性质粒 pMD18
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VirB12制得，所述阳性质粒pMD18
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VirB12质量浓度5
×
103copies/μL，所述阳性膜片直径为2mm；表2中Taqman探针浓度0.2μM，引物浓度0.4μM。
[0014]所述复溶液为ddH2O。
[0015]布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为6个样本使用量，样本量可以扩大到24T、48T及以上。
[0016]布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：
[0017]S1样品富集：取用样品采集管收集的生鲜乳，置于离心机，离心后弃上清；
[0018]S2扩增检测：取出扩增检测管，开盖后采用20μL定量吸管向扩增检测管的孔依次滴加复溶液，向装有阳性膜片、阴性膜片离心管中同样添加20μL复溶液；然后，采用2μL 定量吸管分别吸取富集后的样品沉淀以及阳性膜片、阴性膜片离心管中液体依次加入扩增检
测管各管中，盖盖后用手指轻弹管底3～5下，置于便携式荧光定量PCR仪中，选取预设检测程序，进行扩增检测；
[0019]S3结果判读：反应结束后，阳性对照呈现“S”峰，即具有相应Ct值；样品检测结果的根据Ct值进行判定：Ct值≤32.0判定该样品为布鲁氏菌感染且为强阳性，32.0＜Ct值＜36.0 判定该样品为布鲁氏菌感染且为弱阳性，36.0≤Ct值＜40.0判定该样品为布鲁氏菌疑似感染；
[0020]阴性对照不起峰，即无相应Ct值，判定为布鲁氏菌阴性；否则判定试验结果无效。
[0021]进一步的，便携式荧光定量PCR仪的预设检测程序为：防污染37℃2分钟；预变性 95℃5分钟；变性95℃10秒，退火/延伸60℃20秒，共40个循环。
[0022]进一步的，步骤S1中离心机的转速为12000转/分钟，离心时间为1分钟。
[0023]进一步的，所述布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为6 个样本使用量，样本量可以扩大到24T、48T及以上。
[0024]进一步的，步骤S2中，定量吸管分别吸取2μL富集后的样品沉淀
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0026](1)简单、快速：免去移液器的复杂转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，包括如表1所示的组分：表1 布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分编号名称数量备注1样品采集管6个常温保存2阳性膜片1管常温保存3阴性膜片1管常温保存4扩增检测管1个塑封包装、常温保存5复溶液1管常温保存620μL定量吸管1个常温保存72μL定量吸管8个常温保存8一次性手套1双常温保存9说明书1份常温保存。2.如权利要求1所述的快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增检测管为8连排检测管，所述扩增检测管预装检测试剂和冻干保护剂，其中，检测试剂为：5G聚合酶、UNG酶、10
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qPCR buffer以及如表2所示的布鲁氏菌VirB12基因的特异性引物和Taqman探针，所述10
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qPCRbuffer内含浓度为0.4mM dA/C/GTP、0.8mM dUTP和8mM MgSO4；冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.10
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0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为0.01
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0.02g/mL；表2 布鲁氏菌VirB12基因的特异性引物序列和Taqman探针3.如权利要求2所述的快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性膜片为经FTA Elute Cards，Whatman滴加1μL阳性质粒pMD18
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VirB12制得，所述阳性质粒pMD18
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VirB12质量浓度5
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103copies/μL，所述阳性膜片直径为2mm；表2中Taqman探针浓度为0.2μM，引物浓度为0.4μM。4.如权利要求1所述的快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述复溶液为ddH2O...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹志，张晓轩，尹德华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：