一种二氢嘧啶氨基水解酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种制备(R)

【技术实现步骤摘要】
一种二氢嘧啶氨基水解酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物催化
，涉及一种制备普瑞巴林手性中间体的技术，具体涉及一种利用二氢嘧啶氨基水解酶制备(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸的方法。

技术介绍

[0002]普瑞巴林(Pregabalin)化学名为(S)
‑3‑
氨甲基
‑5‑
甲基己酸，结构式如下，是美国Warner
‑
lambert公司研发的新一代γ
‑
氨基丁酸(γ
‑
GABA)受体激动剂，主要用于治疗外周神经痛以及辅助性治疗局限性部分癫痫发作，其中S
‑
构型的药理活性是R
‑
构型的10倍，因此合成光学纯的手性普瑞巴林对于增强药物疗效、减少非活性对映体引发的副作用具有重要意义。
[0003][0004]目前已报道的普瑞巴林合成方法有不少，但主要是通过不对称催化剂、手性配体的化学不对称合成法，或者是使用化学试剂或商品酶对反应过程中的消旋中间体进行手性拆分。通过高效酶催化潜手性化合物直接获得手性中间体是最经济、有效的途径。其中二氢嘧啶氨基水解酶底物谱较为广泛，可以水解一些酰亚胺、二氢嘧啶和海因，然而它们更倾向于水解一些环酰亚胺类物质。普瑞巴林的手性中间体(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸可以通过水解3
‑
异丁基戊二酰亚胺获得，而3
‑
异丁基戊二酰亚胺是环酰亚胺类化合物。
[0005][0006]因此，推测高选择性、高活性的二氢嘧啶氨基水解酶直接水解3
‑
异丁基戊二酰亚胺可以获得手性中间体(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸。

技术实现思路

[0007]基于上述推测，专利技术人对于多种微生物来源的二氢嘧啶氨基水解酶(Dihydropyrimidinase,EC.3.5.2.2)进行了筛选，包括41种二氢嘧啶氨基水解酶。利用大肠杆菌表达这些二氢嘧啶氨基水解酶，并通过发酵菌体催化3
‑
异丁基戊二酰亚胺发生水解反应，检测反应液中(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸的含量，进行目标二氢嘧啶氨基水解
酶的筛选。
[0008]经过筛选，发现荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens来源的两种二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:1(NCBI登录号：WP_011030900.1)和SEQ ID NO:3(NCBI登录号：WP_011334810.1)能够催化3
‑
异丁基戊二酰亚胺反应生成(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸。
[0009]因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种酶催化法制备(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸的技术方案。
[0010]一种制备(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸的方法，其包括如下步骤：以3
‑
异丁基戊二酰亚胺为底物，使用二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3催化开环反应，得到(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸。
[0011]其中，第一种二氢嘧啶氨基水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
[0012]MSSRTVIRGGLVITASDEIHADVLIEDGRVAALAATGTPAAEAFTAENVIDASGKYVIPGGVDGHTHMEMPFGGTYAADTFETGTRAAAWGGTTTIVDFAIQSVGHSLREGLDAWHAKAEGNCAIDYGFHMIVSDVNQETLKEMDLLVEEGVTSFKQFMAYPGVFYSDDGQILRAMQRAAENGGLIMMHAENGIAIDVLVEQALARGETDPRFHGEVRKALLEAEATHRAIRLAQVAGAPLYVVHVSATEAVAELTRARDEGLPVFGETCPQYLFLSTDNLAEPDFEGAKYVCSTPLRPKEHQAALWRGLRTNDLQVVSTDHCPFCFSGQKELGRGDFSRIPNGMPGVENRMDLLHQAVVEGHIGRRRWIEIACATPARMFGLYPKKGTIAPGADADIVVYDPHAEQVISAETHHMNVDYSAYEGRRITGRVETVLSRGEPVVTEREYTGRKGHGAYTPRATCQYLT(SEQ ID NO:1)；
[0013]第二种二氢嘧啶氨基水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3：
[0014]MSLLIRGATIVTHDESYRADVYCADGVIKAIGENLDIPAGAEVLDGSGQYLMPGGIDPHTHMQLPFMGTVASEDFYSGTAAGLAGGTTSIIDFVIPNPQQSLLEAFHQWRGWAEKSASDYGFHVAITWWSEQVREEMAELVSHHGINSFKHFMAYKNAIMAADDTLVASFERCLELGAVPTVHAENGELVYHLQRKLMAQGITGPEAHPLSRPSQVEGEAASRAIRIAETIGTPLYLVHVSTKEALDEITYARSKGQPVYGEVLAGHLLLDDSVYQHPDWQTAAGYVMSPPFRPRGHQDALWHGLQSGNLHTTATDHCCFCAEQKAAGRDDFSKIPNGTAGIEDRMAVLWDEGVNSGRLSMQDFVALTSTNTAKIFNLYPRKGAIRVGADADLVLWDPQGTRTISAKTHHQQVDFNIFEGKTVTGVPSHTVSQGRVVWADGDLRAERGAGRYIERPAYPAVFDLLSKRAEQHKPTAVKR(SEQ ID NO:3)。
[0015]在一种实施方式中，上述二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3可以呈酶的形式例如游离酶或固定化酶，也可以呈其表达微生物菌体形式。
[0016]上述微生物可以是任何适合于表达上述二氢嘧啶氨基水解酶的微生物，例如选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。
[0017]优选地，所述微生物是大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
[0018]本专利技术的第二个方面提供了一种编码上述二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3的基因。当上述二氢嘧啶氨基水解酶的表达宿主是大肠杆菌时，上述二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:1的编码基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:2，但不限于此；上述二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:3的编码基因的核苷酸序列可以是为SEQ ID NO:4，但不限于此。
[0019]上述编码基因可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：以3
‑
异丁基戊二酰亚胺为底物，使用二氢嘧啶氨基水解酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3催化开环反应，得到(R)
‑3‑
(氨甲酰甲基)
‑5‑
甲基己酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氢嘧啶氨基水解酶呈酶形式或者呈其表达微生物菌体形式。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶为固定化酶。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物选自枯草芽孢杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大龙，蒙传珍，
申请(专利权)人：杭州酶因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：