生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，其包括：以初始浸润液对待检测耗材进行预处理，获得待检测试样；将待检测试样均匀分为多份，并分别加入PCR试剂盒进行PCR检测，直至获得待检测试样的Ct值，定义为试样组Ct值；将初始浸润液预处理后，也加入PCR试剂盒进行PCR检测，由此获得初始浸润液组的Ct值，定义为对照组Ct值；依据ΔCt的数值判定生物耗材中是否有PCR抑制剂残留，ΔCt＝试样组Ct值

【技术实现步骤摘要】
生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法


[0001]本专利技术具体涉及一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]PCR用生物耗材在生产、包装、运输等过程中容易残留各种抑制PCR反应的各类物质，如苯酚、聚丙烯、二甲苯胺等，从而会对PCR扩增效率等造成不良影响。为避免使用残留有PCR抑制剂的不合格生物耗材所带来的检测准确性差等问题，一般需要预先对PCR用生物耗材中PCR抑制剂的残留情况进行检测。理论上来说，气/液相色谱法、质谱法、光谱法等均可以用于检测生物耗材PCR抑制剂残留，但是其需要较为复杂的预处理过程，且未考虑到PCR反应过程中DNA模板、引物及其它PCR所需组件等与生物耗材的相互作用及人为因素的干扰，因此检测结果往往与实际情况存在较大偏差。本申请人此前也开发过一种检测PCR用生物耗材中PCR抑制剂的方法，其主要是利用荧光定量PCR试剂SYBR GREEN检测预处理过生物耗材的去离子水，再检测荧光量来判定是否存在PCR抑制剂，但此种方法仍无法实现精准检测。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的在于提供一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，从而克服现有技术的不足。
[0004]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0005]本专利技术实施例提供了一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，其包括：
[0006]S1、将待检测的生物耗材浸入初始浸润液，并在37℃放置1
‑
2h，之后取出所述生物耗材，而将余留的浸润液作为待检测试样在室温下静置1
‑
2h，然后均匀地分成m份，m≥3，分别记为溶液A1、溶液A2、
…
溶液A
m
；
[0007]S2、将溶液A1均匀地分成n份，n≥3，分别标记为溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
；
[0008]S3、在溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
中分别加入PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含过量的荧光试剂及PCR扩增组件；
[0009]S4、进行PCR实验，并在PCR扩增阶段根据实际实验信息确定基线与阈值，当扩增反应达到阈值时，分别记录溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
中每一个溶液中达到阈值时的Ct值，再排除其中被污染样本的Ct值，并计算剩余样本的Ct值的平均值，由此获得溶液A1组的Ct值；
[0010]S5、根据溶液A1组的Ct值，选择对溶液A2进行稀释或浓缩后继续进行检测；
[0011]S6、按照步骤S2
‑
步骤S5的操作，对溶液A2、
…
溶液A
m
的Ct值继续进行检测，直至连续三次测得的溶液Ai组的Ct值均＞10而＜35，i＝1、2、3、
…
m，即获得待检测试样的Ct值，定义为试样组Ct值，同时确定以该溶液Ai组进行PCR实验时所对应的合适DNA模板浓度；
[0012]S7、将初始浸润液在37℃放置1
‑
2h后，再在室温下静置1
‑
2h，然后加入PCR试剂盒，并使其中的DNA模板浓度达到所述的合适DNA模板浓度，之后按照步骤S2
‑
步骤S4的操作进
行PCR实验，由此获得初始浸润液组的Ct值，定义为对照组Ct值；
[0013]S8、依据ΔCt的数值判定生物耗材中是否有PCR抑制剂残留，其中ΔCt＝试样组Ct值
‑
对照组Ct值。
[0014]在一些实施方式中，所述步骤S1包括：将待检测的生物耗材置入无菌袋中，并加入初始浸润液浸没所述生物耗材，且使所述生物耗材与初始浸润液的质量体积比在1g：10mL以下，再在37℃放置1
‑
2h，之后取出所述生物耗材，获得所述待检测试样。
[0015]在一些实施方式中，步骤S3中所述荧光试剂包括SYBR Green试剂。所述PCR扩增组件是本领域习知的，其包括DNA模板、引物、dNTP、Taq DNA Polymerase、MgCl2、缓冲液等常规组分。
[0016]在一些实施方式中，所述步骤S4具体包括：将所述基线设置为PCR初始扩增阶段PCR产物的量，并将所述阈值设置为所述基线的10倍。
[0017]在一些实施方式中，所述步骤S4具体包括：若溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
中一个溶液达到阈值时的Ct值与所有溶液达到阈值时的Ct值的平均值相差大于0.5，则将该溶液视为被污染样本。
[0018]在一些实施方式中，所述步骤S4中对溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
采用重复性检测方法。
[0019]在一些实施方式中，所述步骤S5具体包括：
[0020]若溶液A1组的Ct值≤2，则将溶液A2稀释为溶液A1的10倍稀释液，溶液A3稀释为已经过10倍稀释的溶液A2的10倍稀释液(即溶液A1的100倍稀释液)，以此类推；
[0021]若溶液A1组的Ct值≥35，则将溶液A2浓缩为溶液A1的10倍浓缩液，溶液A3浓缩为已经过10倍浓缩的溶液A2的10倍浓缩液(即溶液A1的100倍浓缩液)，以此类推；
[0022]若2＜溶液A1组的Ct值＜35，则将溶液A2浓缩为溶液A1的2倍浓缩液，溶液A3浓缩为2倍浓缩后的溶液A2的2倍浓缩液，以此类推；
[0023]并且，当溶液A1组的Ct值≤2或者≥35，且已经过10倍稀释或者已经过10倍浓缩的溶液A2组的Ct值变化为＞2且＜35时，则将溶液A3浓缩为已经过10倍稀释或者已经过10倍浓缩的溶液A2的2倍浓缩液，以此类推。
[0024]其中，步骤S7中的初始浸润液是未经生物耗材浸入过的。
[0025]在一些实施方式中，所述步骤S8具体包括：若ΔCt＞2，则判断待检测生物耗材中有PCR抑制剂残留；若ΔCt≤2，则判断待检测生物耗材中无PCR抑制剂残留。
[0026]在一些实施方式中，所述生物耗材为PCR用生物耗材，例如PCR扩增管等，所述PCR抑制剂包括苯酚、聚丙烯、二甲苯胺中的任意一种或多种的组合，且均不限于此。
[0027]在一些实施方式中，所述初始浸润液采用1
×
TE缓冲液(1
×
TE Buffer)。
[0028]与现有技术相比较，本专利技术提供的生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法综合考量了生物耗材在PCR扩增反应中受到的多种影响，且可以避免人为因素的影响，能够实现对生物耗材中PCR抑制剂残留情况的精准、快速、高通量的检测。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，其特征在于包括：S1、将待检测的生物耗材浸入初始浸润液，并在37℃放置1
‑
2h，之后取出所述生物耗材，而将余留的浸润液作为待检测试样在室温下静置1
‑
2h，然后均匀地分成m份，m≥3，分别记为溶液A1、溶液A2、
…
溶液A
m
，所述初始浸润液采用1
×
TE缓冲液；S2、将溶液A1均匀地分成n份，n≥3，分别标记为溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
；S3、在溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
中分别加入PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含过量的荧光试剂及PCR扩增组件；S4、进行PCR实验，并在PCR扩增阶段根据实际实验信息确定基线与阈值，当扩增反应达到阈值时，分别记录溶液A
11
、溶液A
12
、
…
溶液A
1n
中每一个溶液中达到阈值时的Ct值，再排除其中被污染样本的Ct值，并计算剩余样本的Ct值的平均值，由此获得溶液A1组的Ct值；S5、根据溶液A1组的Ct值，选择对溶液A2进行稀释或浓缩后继续进行检测，其中：若溶液A1组的Ct值≤2，则将溶液A2稀释为溶液A1的10倍稀释液，溶液A3稀释为已经过10倍稀释的溶液A2的10倍稀释液，以此类推；若溶液A1组的Ct值≥35，则将溶液A2浓缩为溶液A1的10倍浓缩液，溶液A3浓缩为已经过10倍浓缩的溶液A2的10倍浓缩液，以此类推；若2＜溶液A1组的Ct值＜35，则将溶液A2浓缩为溶液A1的2倍浓缩液，溶液A3浓缩为2倍浓缩后的溶液A2的2倍浓缩液，以此类推；并且，当溶液A1组的Ct值≤2或者≥35，且已经过10倍稀释或者已经过10倍浓缩的溶液A2组的Ct值变化为＞2且＜35时，则将溶液A3浓缩为已经过10倍稀释或者已经过10倍浓缩的溶液A2的2倍浓缩液，以此类推；S6、按照步骤S2
‑
步骤S5的操作，对溶液A2、
…
溶液A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张衡，丁贤明，
申请(专利权)人：赛宁苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：