一种新的具有NMN合成路径的重组微生物及生产方法技术

本发明专利技术提供了一种新的具有烟酰胺单核苷酸（NMN）合成路径的重组微生物及生产方法。其中所述新的合成路径由1)过表达烟酸磷酸核糖转移酶转化烟酸合成烟酸单核苷酸，2）过表达外源的烟酸单核苷酸酰胺化酶，催化烟酸单核苷酸合成烟酰胺单核苷酸。合成烟酰胺单核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
一种新的具有NMN合成路径的重组微生物及生产方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及利用基因工程等方法改造微生物，改造后的微生物在外源添加烟酸(NA)的情况下，菌种能够将烟酸转化成目标产物NMN并输出到细胞外。

技术介绍

[0002]NMN，即β-nicotinamide mononucleotide，化学名称β-烟酰胺单核苷酸，分子式C
11
H
15
N2O8P，分子量334.22，是一种自然存在的生物活性核苷酸，有2种不规则存在形式α和β，β异构体是NMN的活性形式。
[0003]NMN属于维生素B族衍生物范畴，在人体细胞能量生成中扮演重要角色，它参与细胞内NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的合成。在人体内，NMN通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。还有研究表明，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN通过参与和调节机体的内分泌，起到防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。因此，NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。
[0004]在日常食物，如蔬菜、水果和肉制品中，都含有丰富的NMN。目前NMN的体外制备方法以化学合成为主，如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。但是这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题，因此需要开发低成本环保的NMN生产方法。
[0005]目前制备NMN的最环保最好的方法是生物合成方法，即采用烟酰胺磷酸合成转移酶Nampt催化烟酰胺NAM生成NMN，但是现有的天然Nampt普遍存在酶活性较低的问题，因此有耗时长、成本高、收率低的缺点，难以实现工厂化大规模生产等问题，限制了NMN的大规模应用。

技术实现思路

[0006]基于
技术介绍
介绍的NMN生产现状存在的问题，本专利技术提供一种新的NMN合成代谢路径的重组微生物以及利用该重组微生物发酵生产NMN的新方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种新的具有NMN合成路径的重组微生物，具有NMN合成代谢路径：在细胞中过表达烟酸磷酸核糖转移酶，将外源添加的底物烟酸催化成烟酸单核苷酸，然后过表达烟酸单核苷酸酰胺化酶催化烟酸单核苷酸生成NMN。
[0008]具体的，本专利技术的目的之一，在于提供一种新的NMN合成代谢路径的重组微生物，所述重组微生物过表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸酰胺化酶，以烟酸(NA)为底物发酵合成NMN。
[0009]具体所述酶为如下蛋白：
[0010](a)烟酸磷酸核糖转移酶为大肠杆菌pncB基因编码的蛋白；
[0011](b)烟酸单核苷酸酰胺化酶分别为FtnadE*、FnnadE*和MnnadE*基因编码的蛋白；
[0012](c)FnnadE*编码的蛋白的核苷酸序列如Seq ID No1所示；
[0013](d)MnnadE*编码的蛋白的核苷酸序列如Seq ID No2所示。
[0014]作为优选的技术方案，是将烟酸磷酸核糖转移酶和FnnadE*编码的烟酸单核苷酸酰胺化酶进行共表达，实现外源底物NA到NMN的催化生成。
[0015]本专利技术的目的之二，在于提供一种不表达利用和降解NMN的酶的编码基因的重组微生物，使细胞能够积累NMN。
[0016]作为优选的技术方案，所述宿主是大肠杆菌。作为进一步优选的技术方案，首先将野生型大肠杆菌W3110中NMN脱酰胺酶(催化NMN转变成NaMN)编码基因pncC、烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶编码基因nadR(催化NMN到NAD)进行敲除，得到的宿主在添加NMN发酵的情况下会有极少量NR检测到。优选的，进一步将可能催化NMN的去磷酸化酶(去磷酸化酶主要催化单核苷酸到对应的核苷产物)，如CDP-二酰甘油双磷酸酶编码基因cdh、5'-核苷酸酶编码基因ushA酸性磷酸酶编码基因aphA以及碱性磷酸酶编码基因phoA、进行敲除，结果显示NMN降解程度变低。
[0017]本专利技术的目的之三，在于提供一种NMN的生产方案。
[0018]作为优选的技术方案，具体的包括：1)构建烟酸磷酸核糖转移酶基因和烟酸单核苷酸酰胺化酶基因的共表达质粒；2)构建不能降解和利用NMN的基因工程菌；3)将1)的重组质粒转化2)的基因工程菌中；4)培养如3)的重组菌株，通过添加异丙基硫代半乳糖IPTG诱导重组质粒上基因的表达；5)IPTG诱导同时添加底物NA进行发酵。
[0019]本专利技术提供了一种利用新的NMN合成代谢路径的重组微生物生产NMN的方案，是利用NAD从头合成途径有中间产物NaMN和外源添加底物NA转化成NaMN，进一步催化生成NMN，NA有3种商品规格，即食品级、饲料级和医药级，目前生产工艺成熟，价格低廉；本专利技术利用大肠杆菌基因工程菌发酵来实现，与以前利用酵母比较，流程相对简单，各种投入和成本大大降低。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术制备NMN发酵工艺简单、耗时短、成本低，底物烟酸价格低廉，相对收益率较高。
附图说明：
[0021]图1为大肠杆菌NMN相关的代谢路径；
[0022]其中：NA：烟酸；NR，烟酰胺核糖；Asp:天冬氨酸；QA，喹啉酸；NaMN，烟酸单核苷酸；NaAD，烟酸腺嘌呤二核苷酸；NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAM，烟酰胺；NMN，烟酰胺单核苷酸；NadC：喹啉酸磷酸核糖基转移酶；NadD：烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶；NadE：NAD合成酶；NadR，烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶；PncA：烟酰胺酶；PncB：烟酸磷酸核糖基转移酶；PncC：NMN脱酰胺酶；DeoD：嘌呤核苷磷酸化酶I；XapA：嘌呤核苷磷酸化酶II；UshA：5'-核苷酸酶；Cdh：CDP-二酰甘油双磷酸酶、AphA：酸性磷酸酶；
[0023]图2HPLC检测图谱；
[0024]图3重组菌株摇瓶发酵生产NMN。
Natl Acad Sci USA,97(12):6640-6645)，相应的基因敲除引物见Baba 2006.Mol Syst Biol,2(1)0008。
[0037]实施例4摇瓶发酵验证重组菌株的方法
[0038]验证重组菌株在摇瓶发酵中生产NMN的发酵培养基，具体为每升培养基中YC溶液100ml，5倍的盐溶液200ml，TM2溶液1ml，柠檬酸铁10mg，无水硫酸镁120mg，氯化钙111mg，硫胺素1ug，以去离子水定容，其中YC溶液为甘油2g，蛋白胨0.6g，酵母粉0.2g，去离子水100ml；5倍的盐溶液含有磷酸氢二钠30g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵5.0g，以去离子水定容至1L；TM2溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新的具有NMN合成路径的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物过表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸酰胺化酶，以烟酸（NA）为底物发酵合成NMN。2.根据权利要求1所述的新的NMN合成路径的重组微生物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：江君君，万丽花，陆红霞，胡志浩，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：