高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产β-烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种高产β-烟酰胺单核苷酸（NMN）的重组微生物，以及利用该重组微生物生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，重组微生物菌种含有一个或几个下列特征或全部特征，这些特征是：（1）在发酵培养基中添加烟酰胺经由重组微生物转化生成NMN；（2）过表达了烟酰胺磷酸核糖转移酶；（3）重组微生物基因组上编码5

【技术实现步骤摘要】
高产
β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产
β-烟酰胺单核苷酸的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种或多种高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物的构建，以及利用重组微生物生产β-烟酰胺单核苷酸。

技术介绍

[0002]烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN CAS:1094-61-7)是一种自然存在的生物活性核苷酸，有α和β2种不规则存在形式；而β-异构体是NMN的活性形式，分子式C
11
H
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N2O8P，分子量334.22。它含有一分子烟酰胺组分，因为烟酰胺属于维生素B3，因此NMN也被归纳到维生素B族衍生物，它是在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，EC 2.4.2.12)催化下，由烟酰胺(Nam)与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应的产物，同时是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD
+
)补救合成途径的关键前体。哺乳动物体内的NAD
+
经由细胞内的各种酶生成NMN和Nam，在NAD
+
供应不足时，细胞会重新利用NMN和Nam来合成NAD
+
。Nam在Nampt的催化下生成NMN，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)的催化下生成NAD
+
，即NMN在人体内通过转化为NAD
+
来发挥其生理功能，如激活NAD
+
底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。
[0003]近期的研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用，因此，NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。
[0004]NMN的体外制备方法分为化学合成，半酶法合成和全酶法合成，其中以化学合成为主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应，这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题；半酶法合成是利用化学合成制备烟酰胺核糖，再利用烟酰胺核糖激酶和外源的ATP合成NMN；全酶法则是利用烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺，磷酸核糖焦磷酸和ATP直接合成NMN。采用Nampt催化Nam生成NMN，不仅需要酶法合成磷酸核糖焦磷酸，整个合成中需要大量昂贵的ATP，而且由于现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的酶活性较低，使得酶法反应存在耗时长、成本高、收率低等问题，难以实现工厂化大规模生产，因此限制了NMN的大规模应用。
[0005]生物发酵法生产NMN，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NMN，克服酶法生产中的限制因素，其优势在于以糖质为原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低。

技术实现思路

[0006]本专利技术之目的是利用基因工程手段构建具有高产NMN的生物合成和积累能力的重组微生物，从而在菌种发酵过程中生产大量NMN，达到绿色环保低成本的NMN生产。
[0007]技术方案
[0008]本专利技术的技术方案可以应用大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、沙门氏菌(salmonella)、酵母菌(Yeast)或者其他的微生物，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。
[0009]在微生物中，NMN是烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)由烟酰胺(NAM)和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)产生的NAD
+
生物合成的中间体。NAD
+
的两种典型的从头合成途径涉及三个主要的酶：喹啉酸磷酸核糖基转移酶(NadC，EC 2.4.2.19)、烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶(NadD，EC 2.7.7.18)、NAD
+
合成酶(NadE，EC 6.3.1.5)，NadC将来自磷酸核糖基焦磷酸的磷酸核糖基部分转移到喹啉酸氮并催化随后的中间体脱羧以产生烟酸单核苷酸(NaMN)，NadD利用三磷酸腺苷(ATP)腺苷酸化NaMN，从而产生烟酸二核苷酸(NaAD)，NadD还能够腺苷酸化NMN，但与使用NaMN作为底物时相比，具有较低的活力，NAD
+
生物合成的最后一步由NadE催化，NadE利用氨或谷氨酰胺作为氨基供体将NaAD酰胺化为NAD
+
。
[0010]除了从头合成途径外，NAD
+
还有多种补救途径，如NMN补救途径：NMN通过烟酰胺核苷酸酰胺酶(E.coli中的PncC，B.subtilis中的CinA，EC3.5.1.42)的作用被再循环为NaMN，胞外NMN通过周质酸性磷酸酶(E.coli中的UshA，B.subtilis中的YfkN，EC 3.1.3.5)或许多未知的磷酸酶去磷酸化生成烟酰胺核糖(NR)，并且胞外NR可以通过NR转运体(E.coli中的PnuC，B.subtilis中的NupG)被导入细胞，进而通过烟酰胺核糖苷激酶(E.coli NadR，EC 2.7.1.22)被磷酸化成NMN或在可逆反应中通过嘌呤核苷磷酸化酶(E.coli中的DeoD，B.subtilis中的DeoD，PupG，Pdp，EC 2.4.2.1)被降解为Nam，Nam可以通过DeoD被磷酸核糖基化为NMN或通过烟酰胺酶(PncA，EC3.5.1.19)被脱胺为烟酸(NA)；NA通过烟酸磷酸核糖基转移酶(E.coli中的PncB,B.subtilis中的YueK EC 6.3.4.21)分别被转变为NaMN。
[0011](1)去除利用和降解NMN的编码基因使NMN不再参与细胞中的代谢
[0012]本专利技术以大肠杆菌为例，依次敲除降解NMN至NR已知的各种磷酸酶编码基因，如ushA、aphA、CDP-二酰基甘油二磷酸酶的编码基因cdh；催化NMN至NaMN的烟酰胺核苷酸酰胺酶的编码基因pncC；利用NMN合成NAD
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的烟酰胺核糖苷激酶的编码基因nadR以及消耗底物烟酰胺生成烟酸的烟酰胺酶编码基因pncA。通过上述方法，减少NAD
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合成中NMN的补救路径，即削弱或者中断NMN的降解和利用，从而使细胞在生长过程中积累NMN。
[0013](2)去除与NMN合成有底物竞争的编码基因
[0014]进一步的，本专利技术通过将nadC基因敲除，同时在细胞生长时补喂NA，通过上述方法，使重组微生物不表达基因nadC编码的喹啉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物具有如下至少一个特征：所述重组微生物利用烟酰胺生产β-烟酰胺单核苷酸；所述重组微生物中编码5
’-
脱氧核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。2.如权利要求1所述的高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物中编码5
’-
脱氧核苷酸酶的基因yfdR缺失或失活或活力降低。3.如权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：万丽花，江君君，田锋，陆红霞，胡志浩，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：