本发明专利技术是研究METTL3或14介导m6A修饰调控EC转移的方法，包括以下步骤：1)在临床水平实验研究METTL3/14、HNRNPG、m6A、ERaD7在EC患者中表达多态性；2)在细胞模型中实验研究METTL3、METTL14调控m6A修饰及HNRNPG功能在肿瘤转移中的用；3)在PDX小鼠模型中实验研究调控METTL3/14影响EC肿瘤干细胞成瘤、转移能力。本发明专利技术的优点：可研究METTL3/14在EC干细胞中调控m6A修饰水平进而影响HNRNPG与目标RNA结合，从何影响ERa可变剪切调控及ERaD7特定转录产物表达水平的分子机制，为在EC中提高m6A修饰水平，探索潜在治疗手段提供新思路。探索潜在治疗手段提供新思路。
【技术实现步骤摘要】
研究METTL3或14介导m6A修饰调控EC转移的方法
[0001]本专利技术涉及的是研究METTL3或METTL14介导m6A修饰调控子宫内膜癌转移机制的方法，属于生物医药
技术介绍
[0002]子宫内膜癌(Endometrial Cancer：EC)在女性肿瘤中占比高达6％，是西方世界最常见的妇科恶性肿瘤。子宫内膜癌每年的发生率在15～20/100000人，其中89％发生在65～59周岁年龄段。虽然75％患者在早期即可得到治疗，但大约20％的患者在原发灶切除后复发。EC主要分为两种类型：雌激素依赖型I，指过分暴露于失去黄体酮调节的雌激素，表现为非排卵性子宫出血、不孕、更年期推迟、肥胖、子宫内膜增生等；非雌激素依赖型II，无明显症状、无代谢紊乱，但具有预后差、易转移的特点，占整体EC的10％-15％，其致死率却占整体EC的40％。
[0003]转移性EC患者的中位生存期仅有7-12个月，且EC的复发转移与CD133+EC肿瘤干细胞密切相关。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是一类在肿瘤组织中数量稀少，但具有抗药性的细胞群体，它可不断自我更新并产生分化的肿瘤组织，是肿瘤复发、转移的主要元凶。从32例人类EC肿瘤组织中分离的CSC具有很强的自我更新能力、成克隆能力、及贯序肿瘤生成能力，并且这些能力的高低与肿瘤分级水平正相关。因而，针对EC肿瘤干细胞的分子机理研究将为EC复发、转移的防治提供理论基础及新思路。
[0004]在I型EC中，雌激素受体alpha(ERa/ESR1)表达缺失通常与肿瘤组织分化不完全相关，预示生存率不佳；ERa可变剪切产物在正常和癌变的子宫内膜组织中表达不同；暗示其可变剪切产物具备不同的生物学功能，可能与肿瘤的发生、发展相关。根据之前报道ERa基因有7种可变剪切mRNA产物(ERaD1-D7)：ERaD4跳过外显子4无法与DNA或配体结合，因而不具备激活雌激素依赖下游基因表达的功能；ERaD3和ERaD7(分别跳过外显子3、7)具有显性负相(Dominant negative)功能，可干扰正常的ERa功能，但无法激活ERa下游转录；ERaD5不需与配体结合即可持续激活ERa下游基因表达。在正常和肿瘤子宫内膜组织中，ERaD4，D5和D7均有表达，ERaD7在正常子宫内膜中表达于细胞增殖阶段，而非细胞分泌阶段；ERaD7在EC组织中表达于轻微分化瘤，而非未分化瘤中。ERaD7编码蛋白失去其与荷尔蒙的结合域，不仅显性负相调控ERa，也可显性负相调控ERb。ERa的7号外显子具有于2种互相拮抗的剪接因子HNRNPG及HTRA2-BETA1的结合位点，其可变剪切受到HNRNPG及HTRA2-BETA1调控：HTRA2-b1促进外显子7在剪切过程中的保留，而HNRNPG与HTRA2-BETA1拮抗，促进外显子7的跳过(ERaD7水平升高)。
[0005]HNRNPG是不均一核糖核蛋白家族(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-hnRNP)中的一员,hnRNPs在RNA加工、转录、pre-mRNA剪切、核质运输、胞质mRNA翻译与周转中具有重要的生物学功能。HTRA2-BETA1隶属于精氨酸-丝氨酸富集蛋白(arginine-serine rich proteins-SR proteins),是除hnRNP之外另一种调控剪接过程的重要蛋白类型。酵母双杂交实验表明，HNRNPG和HTRA2-BETA1可相互作用；HNRNPG与HTRA2-BETA1在肌肉组织表
达基因αs-tropomyosin及dystrophin可变剪切中互相拮抗。这些研究结果表明，HNRNPG和HTRA2-BETA1可在其他组织中相互拮抗，调控某些特定mRNA同工型的表达，因而调控蛋白的生物学功能。在肿瘤中，HNRNPG被认为具有肿瘤抑制功能而HTRA2-BETA1被认为具有肿瘤促进功能(卵巢癌及乳腺癌中高表达，且其功能依赖于浓度及底物结合序列)。在EC中，HNRNPG与HTRA2-BETA1是EC患者无进展生存期(PFS)的独立预测因子：HNRNPG水平较高患者通常预后较好，且HNRNPG在细胞核内表达水平与远处转移负相关；HTRA2-BETA1核内表达水平与肿瘤细胞分化水平负相关，且与肿瘤淋巴转移正相关。与在其他肿瘤中类似，在EC中HNRNPG与HTRA2-BETA1作为生物指标，可预示相反的临床结果。与HNRNPG类似，ERaD7 mRNA的高表达在EC中预示着较好的无进展生存期，其具体机制可能与HNRNPG促进形成ERaD7，并编码产生显性负相ERa，抑制其下游生长相关信号通路(AP-1，SP1，NF-kB等)有关。然而，在EC中HNRNPG调控ERa的具体分子机理尚未阐明。
[0006]HNRNPG与RNA的结合受m6A甲基化修饰调控。m6A(mRNA N6位置甲基化)是真核生物mRNA及lnRNA上最常见的一种转录后修饰，是近年来研究的热点，参与细胞分化、胚胎发育、肿瘤进展等多种生理或病理过程：如肥胖、神经性疾病及雄性生殖能力等。m6A水平、分布及功能在体内的调控主要通过“写入蛋白”、“擦除蛋白”及“阅读蛋白”介导：写入蛋白包括METTL3-METTL14-WTAP，在RNA上形成m6A修饰；擦除蛋白包括FTO(fat mass and obesity-associated protein)及ALKBH5，可去除RNA上的m6A修饰；阅读蛋白包括YTH可识别m6A修饰，并调控mRNA的翻译。最新研究利用siRNA在人类细胞模型(HeLa及HEK293T)中分别沉默METTL3，METTL14及HNRNPG，发现HNRNPG倾向于通过其C端的Arg-Gly-Gly重复序列与具m6A修饰的RNA结合并调控该RNA的表达。HNRNPG结合序列中的m6A修饰可改变RNA的空间构型，增进HNRNPG与该结合序列的亲和性，且m6A修饰的HNRNPG结合序列在大多数转录产物中存在(13191个m6A修饰的HNRNPG特异性位点)。比较HNRNPG敲减、METTL3或METTL14敲减细胞的RNA-seq数据表明，HNRNPG敲减后基因上下调模式及可变剪切模式的变化与METTL3或METTL14敲减类似，进一步证明HNRNPG的功能受METTL3-METTL14介导的RNA甲基化修饰调控。另外，在Nature Cell Biology中的研究表明：70％EC肿瘤中m6A水平较正常相邻组织低；约有1.5％患者肿瘤组织中存在导致METTL14失去功能的热点突变(氨基酸298)；同时大多数EC肿瘤组织中的METTL3相对于对照正常组织显著降低且METTL3水平降低与死亡率升高正相关；在EC细胞系中选择性敲除METTL14或METTL3皆可致使细胞成克隆性增强、生长速度加快及浸润性能力提升。在乳腺癌中，氧不足导致的ALKBH5高表达可促使m6A去甲基化以及mRNA的m6A修饰水平整体降低，促进CSC形成及肿瘤进展，表明m6A水平降低与肿瘤恶性程度的相关性很有可能是通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.研究METTL3或14介导m6A修饰调控EC转移的方法，其特征是包括以下步骤：1)在临床水平实验研究METTL3、METTL14、HNRNPG、m6A、ERaD7在EC患者中表达的多态性；2)在细胞模型中实验研究METTL3、METTL14调控m6A修饰及HNRNPG功能在肿瘤转移中的作用；3)在PDX小鼠模型中实验研究调控METTL3/METTL14影响EC肿瘤干细胞成瘤、转移的能力。2.如权利要求1所述的研究METTL3或14介导m6A修饰调控EC转移的方法，其特征是所述的步骤1)包括：
①
采集实验组和对照组组成的外周血样本，以及新鲜组织样本和石蜡包埋样本组成的组织样本；
②
测定外周血、新鲜组织、CSC细胞中的m6A水平；
③
分离EC肿瘤组织中的CSC细胞；
④
测定外周血、新鲜组织及CSC中METTL3、METTL14、HNRNPG及ERaD7的mRNA表达水平；
⑤
测定新鲜肿瘤组织及分离的CSC中METTL3、METTL14、HNRNPG蛋白表达及下游AP-1、SP-1、NF-kB通路激活水平；
⑥
测定石蜡组织样本中METTL3、METTL14、HNRNPG及ERaD7的mRNA表达水平...
【专利技术属性】
技术研发人员：俞珏华，程禹，
申请(专利权)人：无锡准因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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