一种基于双重RAA-LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于双重RAA

【技术实现步骤摘要】
一种基于双重RAA
‑
LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学技术检测领域，具体涉及一种基于双重RAA
‑
LFD技术的同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的改良引物及试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是水产品中的主要致病菌。副溶血性弧菌广泛存在于鱼类、虾类、贝类等水生动物中，自1950年，Fujino等人首次从沙丁鱼中分离出以来，副溶血性弧菌已被认为是引起全球水产品中毒的重要原因。在中国，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件高居食源性致病菌引起的疾病的首位。霍乱弧菌有200多个血清群，O1和O139血清型霍乱弧菌可引起霍乱。霍乱弧菌在条件较差或者发展较落后的地区尤其流行。据估计，全世界每年发生300万至500万病例和10万多例死亡。副溶血性弧菌和霍乱弧菌在水产养殖环境中的存在，会导致虾等水产动物出现反应迟钝、肌肉泛白、食欲减退和鳃部发黄溃烂等症状，死亡率高，给水产养殖业带来经济损失。因此，对副溶血性弧菌和霍乱弧菌进行快速、准确的检测，是有效控制其流行和传播的前提，能够减少水产养殖业的经济损失，保障消费者的健康。
[0003]传统培养法是检测弧菌的“金标准”，然而耗时长、工作量大，通常需要一周甚至更长的时间，无法满足快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌快速检测的需求。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)因其检测准确性高、检测速度快等特点被应用于检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。然而，PCR方法需昂贵的热循环仪器的辅助，这限制了其在野外条件检测和基层实验室中的应用。此外，环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)方法具有操作简单和成本效益高的特点，已被开发用于检测水产品养殖环境中的副溶血性弧菌和霍乱弧菌，但LAMP法需要设计4～6对引物，较为复杂。
[0004]重组酶等温扩增(Isothermal recombinase aided amplification,RAA)作为一种新型的核酸等温扩增技术，是一种简便、快速、特异、灵敏、经济的鉴定多种病原菌的分子检测方法。目前，基于RAA和侧流层析试纸条(LFD)的方法(RAA
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LFD)已成功应用于创伤弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌的快速检测，实现了野外等偏远地区的现场诊断。然而，目前还没有开发双重RAA
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LFD法用于同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。双重RAA
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LFD法对副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测和流行控制等具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术检测方法的不足，建立一种基于双重RAA
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LFD技术、能够同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法，以实现在野外等资源有限的环境中快速、特异、准确的检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种基于双重RAA
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LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重特异性引物组合，包括两组引物；第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，下游引物序列含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列；
[0008]第二组引物用于特异性扩增霍乱弧菌，上游引物序列含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，下游引物序列含有SEQ ID No.4所示核苷酸序列。
[0009]优选的，所述的第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2；
[0010]第二组引物用于特异性扩增霍乱弧菌，上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
[0011]SEQ ID No.1：tccaaaacgaggctatcaactcatttgcact
[0012]SEQ ID No.2：tcgctaaagacggctctacgattgtttctacc
[0013]SEQ ID No.3：ccattttcacataagatttctacctctggt
[0014]SEQ ID No.4：atgagtcgtcaagttttaaatcactcattc
[0015]进一步，所述的第一组引物和第二组引物，其中一组的上游引物5
’
端修饰生物素类化合物，下游引物5
’
端修饰标记物1；另一组的上游引物5
’
端修饰标记物2，下游引物5
’
端修饰生物素类化合物。所述的标记物1和2为地高辛或荧光素类化合物。
[0016]在本专利技术的一个优选方式中，第一组引物的上游引物5
’
端修饰生物素类化合物，下游引物5
’
端修饰荧光素类化合物；第二组引物的上游引物5
’
端修饰地高辛，下游引物5
’
端修饰生物素类化合物。
[0017]所述的生物素类化合物为生物素，所述的荧光素类化合物为6
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羧基荧光素(6
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FAM)或异硫氰酸荧光素(FITC)，更优选为6
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羧基荧光素。
[0018]上述双重特异性引物组合可用于同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。
[0019]上述双重特异性引物组合可用于制备同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒。
[0020]一种基于双重RAA
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LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒，含有上述双重特异性引物组合。
[0021]优选的，所述试剂盒还含有RAA核酸扩增试剂盒和侧流层析试纸条中的至少一种。
[0022]所述的RAA核酸扩增试剂盒包括冻干粉、基础缓冲溶液、醋酸镁、纯化水、阴性质控品和阳性质控品。
[0023]所述的侧流层析试纸条的上设有T1检测线和T2检测线，分别用于捕获标记物1和标记物2。
[0024]一种基于双重RAA
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LFD技术同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法，步骤包括：
[0025](1)将上述特异性引物组合与待测样品混合，配制RAA反应体系，并在36
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38℃下扩增反应10
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30min；
[0026](2)取扩增产物滴加到侧流层析试纸条的样品垫末端，垂直放入缓冲液中，反应5min后读取结果。
[0027]步骤(1)中，反应时间优选为15
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20min，更优选为15min。
[0028]所述的侧流层析试纸条上设有T1检测线和T2检测线，分别用于捕获标记物1和标记物2。
[0029]侧流层析试纸条的T1检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双重RAA
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LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的特异性引物组合，其特征在于，包括两组引物；第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，下游引物序列含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列；第二组引物用于特异性扩增霍乱弧菌，上游引物序列含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，下游引物序列含有SEQ ID No.4所示核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的特异性引物组合，其特征在于，所述第一组引物的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2；所述第二组引物的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。3.根据权利要求1或2所述的特异性引物组合，其特征在于，所述的第一组引物和第二组引物，其中一组的上游引物5
’
端修饰生物素类化合物，下游引物5
’
端修饰标记物1；另一组的上游引物5
’
端修饰标记物2，下游引物5
’
端修饰生物素类化合物；所述的标记物1和2为地高辛或荧光素类化合物。4.根据权利要求3所述的特异性引物组合，其特征在于，所述第一组引物的上游引物5
’
端修饰生物素类化合物，下游引物5
’
端...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓红，李达容，赵勇，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：