以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术专利公开了一种以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗及其制备方法和应用，该纳米粒疫苗粒径为1nm～300nm，PDI分散指数小于0.3；其制备方法如下：将WT1多肽加入到含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸

【技术实现步骤摘要】
以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及恶行肿瘤治疗领域，具体涉及一种以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗；还涉及该疫苗的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]白血病又称“血癌”，是造血组织的恶性疾病，其特征为白细胞在骨髓及其他造血组织中呈恶性、无限制地增生，进而浸润全身各组织和脏器，对机体产生严重损害。白血病发病率随年龄增长而增加，美国仅在2012年有将近14000名成年人诊断为白血病，这一年中大约10000名白血病患者失去生命。在我国白血病发病率为5～17/10万，儿童及35岁以下成人的死亡率位居恶性肿瘤死亡率的第一位，可见白血病是危害人类主要的恶性肿瘤之一。
[0003]传统的放疗或化疗具有一定的治疗作用，也是目前临床采用的主要治疗方法。但其在杀死白血病细胞的同时，也杀死了体内的正常细胞。中性粒细胞数目的减少易导致感染而严重影响白血病的治疗效果。如果能让白血病病人体内的免疫系统识别肿瘤细胞继而抑制其繁殖，那么肿瘤细胞就无法逃脱免疫系统的监控，从而使高危的急性白血病患者产生针对肿瘤细胞的特异性免疫反应，提高其长期生存率。
[0004]最新研究表明，白血病疫苗能激活一系列免疫增强反应，使免疫系统能够识别并清除白血病细胞，取得了很好的治疗效果。研究表明，白血病疫苗包括白血病细胞疫苗、白血病相关多肽疫苗、树突状细胞疫苗和DNA疫苗，其中多肽疫苗研究尤其火热。WT1(Wilms tumorgene 1)可以诱导特异性细胞及体液免疫反应，并且已经有学者报道WT1多肽疫苗的Ⅰ期临床试验，证明了WT1多肽的免疫原性及安全性。WT1多肽疫苗的临床Ⅱ期试验，验证了WT1疫苗可以诱导有功能的CTL反应，并且可能与临床改善相关。
[0005]但由于多肽疫苗分子量小，免疫原性弱，容易降解，不易被抗原提呈细胞摄取，具有MHC限制性，因此其抗肿瘤活性远不如预期。PLGA有很好的稳定性和安全性，具有易于被吞噬细胞摄取，通过在颗粒表面吸附相应的配体可以定位到特定的组织或器官等优点，美国食品药品管理局(FDA)已认定PLGA有良好的生物相容性和安全性。同时美国德克萨斯大学西南医学中心的高金明教授和美国国家科学院院士陈志坚教授等人发现，一种由酸度响应聚合物组成的纳米颗粒(PC7A)与抗原组成的简单复合物不仅可以有效促进抗原在抗原递呈细胞中的胞质输送、显著增强抗原呈递，还可以通过激活Ⅰ型干扰素刺激因子(STING)刺激产生Ⅰ型干扰素，显著增强该纳米疫苗的抗癌效应。国内纳米多肽疫苗的研究有鸡新城疫病毒、禽流感病毒、猪圆环病毒2型等，但是尚未见WT1纳米粒疫苗报道。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗；本专利技术的目的之二在于提供以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供所述以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗在制备治疗急性髓系白
血病药物中的应用。
[0007]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]1、一种以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗，所述纳米粒疫苗由聚乙烯醇、多磷酸钠、聚乳酸
‑
羟基乙酸和壳聚糖包裹WT1多肽，通过溶剂蒸发法交联得到粒径为1
‑
300nm的纳米粒疫苗，所述纳米粒疫苗的PDI值小于0.3，所述WT1多肽氨基酸序列为RM
‑
FPNAPYL。
[0009]优选的，所述WT1多肽的浓度为0.5
‑
4mg/ml。
[0010]优选的，所述聚乙烯醇和多磷酸钠的浓度分别为0.02g/ml和0.002g/ml。
[0011]优选的，所述聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物浓度为0.002～0.02g/ml，加入每45ml含0.01～0.2g聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物。
[0012]优选的，所述壳聚糖溶液的浓度为0.0005～0.01g/ml，加入后每45ml含0.01～0.2g壳聚糖。
[0013]优选的，所述搅拌的转速为800转/min；所述充分分散为以800转/min的速度搅拌8h；所述离心为13000rpm离心10min；所述过滤为用0.22μm滤器头过滤。
[0014]2、以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗的制备方法，具体步骤如下：将WT1多肽溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸
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羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得WT1多肽纳米粒疫苗；或将WT1多肽溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，去除残留乳化剂，冷冻干燥，获得WT1多肽纳米粒疫苗。
[0015]优选的，具体步骤如下：WT1多肽溶液加入含0.02g/ml聚乙烯醇和0.002g/ml多磷酸钠的溶液A中，混匀，然后搅拌下加入丙酮溶解的0.01g/ml聚乳酸
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羟基乙酸共聚物溶液B，混匀，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的0.001g/ml壳聚糖溶液C，充分分散，过滤，离心，洗涤获得WT1多肽纳米粒疫苗；或将WT1多肽溶液加入含0.02g/ml聚乙烯醇和0.002g/ml多磷酸钠的溶液A中，然后搅拌下加入丙酮溶解的0.01g/ml聚乳酸
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羟基乙酸共聚物溶液B，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的0.001g/ml壳聚糖溶液C，充分分散，去除残留乳化剂，冷冻干燥，获得WT1多肽纳米粒疫苗。
[0016]优选的，所述溶液A、B、C的体积比为1：4：4。
[0017]本专利技术更优选的，所述搅拌的转速为800转/min，所述充分分散为以800转/min的速度搅拌8h。
[0018]3、所述以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
[0019]本专利技术的有益效果在于：本专利技术以聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖(CS)、WT1多肽等原辅料，通过处方筛选等，制备出新型的白血病纳米粒多肽疫苗；对纳米粒疫苗的理化特征和稳定性等进行评价；体内毒性研究疫苗体内外安全性，这可为后期白血病治疗疫苗应用奠定坚实基础和提供科学理论依据。
附图说明
[0020]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0021]图1为合成的WT1多肽及鉴定图(A：合成的多肽；B：HPLC实验结果；C：质谱检测结果)；
[0022]图2为不同载药浓度的WT1多肽纳米粒疫苗样品(A)及其粒度(B)、分散性(C)和电位(D)；
[0023]图3为WT1多肽纳米粒疫苗的形态学表征；
[0024]图4为WT1多肽纳米粒疫苗的粒度(A)及电位分布(B)；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗，其特征在于：所述纳米粒疫苗由聚乙烯醇、多磷酸钠、聚乳酸
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羟基乙酸和壳聚糖包裹WT1多肽，通过溶剂蒸发法交联得到粒径为1
‑
300nm的纳米粒疫苗，所述纳米粒疫苗的PDI值小于0.3，所述WT1多肽氨基酸序列为RM
‑
FPNAPYL。2.根据权利要求1所述的WT1多肽纳米粒疫苗，其特征在于：所述WT1多肽的浓度为0.5
‑
4mg/ml。3.根据权利要求2所述的WT1多肽纳米粒疫苗，其特征在于：所述聚乙烯醇和多磷酸钠的浓度分别为0.02g/ml和0.002g/ml。4.根据权利要求2所述的WT1多肽纳米粒疫苗，其特征在于：所述聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物浓度为0.002～0.02g/ml，加入每45ml含0.01～0.2g聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物。5.根据权利要求2所述的WT1多肽纳米粒疫苗，其特征在于：所述壳聚糖溶液的浓度为0.0005～0.01g/ml，加入后每45ml含0.01～0.2g壳聚糖。6.根据权利要求2所述的WT1多肽纳米粒疫苗，其特征在于：所述搅拌的转速为800转/min；所述充分分散为以800转/min的速度搅拌8h；所述离心为13000rpm离心10min；所述过滤为用0.22μm滤器头过滤。7.以壳聚糖修饰PLGA的WT1多肽纳米粒疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将W...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙红武，张泽珑，刘佳晖，杨赟，罗兴，曾小强，叶演，赵世博，涂亚涛，蔡丁一，覃靖怡，吴梓靖，王天芮，欧阳健恒，鲁东水，曾浩，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：