一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒。本发明专利技术通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和探针，结合多重qPCR反应实现了对常见毛霉菌的检测，检出率高达100%，特异性为100%。本发明专利技术公开的检测方法及试剂盒可以用于临床检测常见毛霉菌。试剂盒可以用于临床检测常见毛霉菌。试剂盒可以用于临床检测常见毛霉菌。

【技术实现步骤摘要】
一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及病原微生物检测领域，尤其涉及到一种常见毛霉菌的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]毛霉菌病是一种新兴的由毛霉菌丝状真菌引起的严重感染性疾病，其进展迅速，死亡率高，主要影响免疫功能低下的患者和糖尿病患者。在真菌感染中，毛霉菌发病率占 8.3%
‑
13%，仅次于假丝酵母菌和曲霉菌，位居第3位。近年来，毛霉病在高危人群的发病率有所上升，在免疫缺陷患者常见深部真菌感染中占第二位，在恶性肿瘤及器官移植者中发病率约为1%。据报道，在西方国家中，美国和法国在2000年至2010年期间每年增加约7％，而死亡率则每年增加9.3%。在西班牙，该疾病的发病率从2005年的0.62例/10万人增加到2007年的2015 年的3.3例/10万人。毛霉病在发展中国家的检出也越来越频繁，特别是在印度、中国和拉丁美洲，印度的发病率达14例/10万人。毛霉病感染进展迅速，大多病情凶险，180天内死亡率为56.7%，且死亡大多发生在1月内。毛霉病的发病率未知，而且可能被低估，因其临床表现不典型，诊断困难。
[0003]毛霉病的常规检测方法有痰培养、病理活检、影像学检测，但以上几种方法的的检出率不高，且极易误诊为其他病原体导致的感染。所以，非常有必要发展常见毛霉菌的检测方法。
[0004]本专利技术通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和检测探针，不仅成功地通过多重qPCR反应实现了对常见毛霉菌的检测，而且这些毛霉菌的检出率高达100%，特异性为100%，可以用于临床检测。由此可见，本专利技术可以促进毛霉菌的临床检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和检测探针，结合多重qPCR反应实现了对米根霉，微小根毛霉和伞枝横梗霉等3种常见毛霉菌的检测，检出率高达100%，特异性为100%。
[0006]本专利技术采用如下的技术方案：1）将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：正向引物：5
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CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 01,反向引物：5
´‑
CAGGCGTACTCTATAGAA
‑3´ꢀ
SEQ ID 02,检测探针：5
´‑
TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 03；2）将微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：正向引物：5
´‑
TGTTGACCCTTGATATTTCC
‑3´ꢀ
SEQ ID 04,反向引物：5
´‑
TGTTGACCCTTGATATTTCC
‑3´ꢀ
SEQ ID 05,检测探针：5
´‑
AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 06；3）将计伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：
正向引物：5
´‑
GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA
‑3´
SEQ ID 07,反向引物：5
´‑
CCAAGTAGTGTCCCATAGAT
‑3´
SEQ ID 08,检测探针：5
´‑
GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC
‑3´
SEQ ID 09；4）将制备好的米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为： 25微升Probe mix，1.0
‑
3.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，0.5
‑
1.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，1.0
‑
3.0微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉引物，0.5
‑
1.5微升浓度为10微摩尔每升的伞枝横梗霉探针，1.0
‑
3.0微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉引物，0.5
‑
1.5微升浓度为10微摩尔每升的微小根毛霉探针，5微升检测样本及水；5）使用qPCR仪器进行多重qPCR反应程序，反应条件为：在95
‑
105摄氏度下进行热盖，随后在40
‑
50摄氏度反应4
‑
6分钟，再把温度提高到90
‑
95摄氏度反应5
‑
10分钟；然后在90
‑
95摄氏度每隔10
‑
15秒做40次循环；最后在50
‑
60摄氏度每隔30秒
‑
1分钟做40次循环;6) 反应结束后，若探针所对应通道的荧光读数小于阳性检出阈值，则该探针所检测的样本为阳性。
[0007]本专利技术的积极效果如下：本专利技术通过设计和制备常见毛霉菌特定的正向引物，反向引物和检测探针，结合过多重qPCR反应实现了对米根霉，微小根毛霉和伞枝横梗霉等3种常见毛霉菌的检测，与目前报导的常见毛霉菌的检测方法相比，本方法不仅检出效率高，而且特异性强，可以为病患和医院带来临床检测收益。
附图说明
[0008]图1 是实施例1
‑
12对常见毛霉菌的检测流程图。
具体实施方式
[0009]下面的实施例是对本专利技术的进一步详细描述。
[0010]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0011]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0012]实施例1 米根霉的检测1) 将米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别设计为：正向引物：5
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CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 01,反向引物：5
´‑
CAGGCGTACTCTATAGAA
‑3´ꢀ
SEQ ID 02,检测探针：5
´‑
TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 03；2) 将制备好的米根霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本米根霉质粒进行混合，混合体系的总体积为50微升，所述混合体系的具体组成为：25微升Probe mix，3.0微升浓度为10微摩尔每升的米根霉引物，1.5微升浓度为10微摩尔每升的米根霉探针，5微升米根霉质粒及水；3) 使用qPCR仪器进行多重qPCR反应，反应条件为：在105摄氏度下进行热盖，随后在50摄氏度反应6分钟，再把温度提高到95摄氏度反应10分钟；然后在95摄氏度每隔15秒做
40次循环；最后在60摄氏度每隔1分钟做40次循环;4) 反应结束后，探针所对应通道的荧光读本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种常见毛霉菌的检测方法，其特征在于：S1. 所述米根霉的正向引物，反向引物和检测探针分别为：正向引物：5
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CCTAGAAATTCAGTATTATAAAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 01,反向引物：5
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CAGGCGTACTCTATAGAA
‑3´ꢀ
SEQ ID 02,检测探针：5
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TAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 03；S2. 所述微小根毛霉的正向引物，反向引物和检测探针分别为：正向引物：5
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TGTTGACCCTTGATATTTCC
‑3´ꢀ
SEQ ID 04,反向引物：5
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TGTTGACCCTTGATATTTCC
‑3´ꢀ
SEQ ID 05,检测探针：5
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AAATTAGATACCAATGCAAGCCCTCA
‑3´
SEQ ID 06；S3. 所述伞枝横梗霉的正向引物，反向引物和检测探针分别为：正向引物：5
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GGTTAGTGAGTTCAATAATTCCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 07,反向引物：5
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CCAAGTAGTGTCCCATAGAT
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SEQ ID 08,检测探针：5
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GCATTAAGTCTTTTAATGAACTAGC
‑3´ꢀ
SEQ ID 09；S4. 将S1
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S3步骤中所述的米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的引物及其探针与probe mix加入PCR管中，然后加入检测样本进行混合，混合体系的总...

【专利技术属性】
技术研发人员：童云广，李春艳，张书祖，唐懿，莫秋思，
申请(专利权)人：杭州奥明医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：