一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，旨在提供一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法。本发明专利技术将TRV

【技术实现步骤摘要】
一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种蝴蝶花VIGS基因沉默体系的构建方法。

技术介绍

[0002]病毒诱导的基因沉默(Virus
‑
induced gene silencing，VIGS)是一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反应该基因功能。VIGS技术具有快速、高效、通量高等优点，能够方便快捷地研究基因功能，甚至可以用来研究一些突变后会致死的基因功能，因此该技术被广泛应用于植物生长发育、抗病虫、代谢调控等方面功能基因研究中。
[0003]蝴蝶花(Iris japonica)为鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属宿根花卉，其花叶俱佳，四季常绿，生长适应性强，从我国广东省至陕西省均有分布，是一种良好的园林地被植物。但蝴蝶花遗传再生相对困难，以花器官作为外植体进行愈伤组织诱导效率极低，自然结实率低且种子具休眠特性亦无法用种胚作为外植体，以地下根茎作为外植体则消毒困难，诱导效率也很低，因此利用转基因技术验证蝴蝶花基因功能尚存在技术瓶颈。模式植物中研究已证实：VIGS技术试验周期短，不依赖转基因操作，具有低成本、高通量等优点，目前该技术仍较少应用于单子叶植物中。建立以鸢尾为代表的单子叶植物VIGS技术体系，可快速有效地对该类植物关键基因进行功能验证，对于解析其重要性状分子机制具有理论和实践意义，为实现我国花卉分子育种奠定基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法。
[0005]为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：
[0006]提供一种蝴蝶花基因沉默体系构建方法，包括下述步骤：
[0007](1)蝴蝶花目的基因片段的克隆
[0008]根据蝴蝶花转录组数据注释为目的基因的转录本保守区域设计酶切引物(产物长度约为200
‑
300bp)，并在正向和反向引物5
’
端分别添加限制性内切酶Xba I和Sac I的识别碱基，以及保护碱基序列GCTCTAGA和CGAGCTC；
[0009]提取蝴蝶花RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得目的基因片段；电泳，切胶回收PCR产物；连接pEASY
‑
blunt载体，转化大肠杆菌DH5α感受态；37℃暗培养过夜后挑取单克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性；
[0010](2)构建含蝴蝶花目的基因TRV载体的根癌农杆菌
[0011]提取步骤(1)中经测序验证的含有蝴蝶花目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒；使用Xba I和Sac I两个限制性内切酶对该克隆载体质粒和pTRV2质粒进行酶切，酶切条件37℃、40分钟；电泳、切胶回收目的基因和pTRV2载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将目的基
因和pTRV2载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃、3小时；
[0012]将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，37℃暗培养过夜后挑取单克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物pTRV2
‑
F(5
’‑
TGGGAGATGATACGCTGTT
‑3’
，SEQ ID NO.1)和pTRV2
‑
R(5
’‑
CCTAAAACTTCAGACACG
‑3’
，SEQ ID NO.2)进行阳性单克隆PCR检测并测序；
[0013]提取获得的阳性克隆质粒，使用冻融法转化农杆菌GV3101，28℃暗培养两天后挑取单克隆，使用pTRV2
‑
F和pTRV2
‑
R引物进行阳性单克隆PCR检测；
[0014](3)以农杆菌介导侵染蝴蝶花植株
[0015]将含有pTRV1、pTRV2、pTRV2
‑
报告基因、pTRV2
‑
目的基因片段的农杆菌GV3101菌液50
‑
100μL加入至5mL含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的Luria
‑
Bertani(LB)培养液，放入摇床中28℃、200rpm摇菌16小时，再转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、10mM MES(2
‑
吗啉乙磺酸)和20μM AS(腺嘌呤硫酸盐)的150ml LB液体培养基，放入摇床中28℃、200rpm摇菌16小时；当菌液的OD
600
为1.5
‑
2.0时，4000rpm、25℃离心10分钟收集菌体；用含有10mM MgCl2、10mM MES、200μM AS的150ml侵染缓冲液分别重悬菌体；取含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2的农杆菌GV3101菌液，按照体积比1:1混合(以此用于参照系)；取含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2
‑
报告基因的农杆菌GV3101菌液，按照体积比1:1混合；取含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2
‑
目的基因片段的农杆菌GV3101菌液，按照体积比1:1混合；25℃避光静置活化4小时；
[0016]以混合后的农杆菌GV3101菌液分别对蝴蝶花植株进行侵染处理；将植株在湿度60％，20
‑
21℃环境暗培养3天之后，改为在湿度60％，光照14
‑
16小时、25℃、4000lxs/黑暗10
‑
8小时、18℃条件继续培养直至出现表型。
[0017](4)基因沉默植株的检测
[0018]首先经过一段时间观察，记录侵染植株形态变化，选择其中出现预期表型的植株，提取其叶片总RNA并反转录成cDNA，使用pTRV2
‑
F和pTRV2
‑
R引物进行PCR，检测带目的基因的pTRV2重组载体是否进入植物体内；使用qPCR对野生型(Untreated)、仅转入pTRV2空载(TRV)和含目的基因
‑
pTRV2重组载体的植株进行目的基因表达定量，其中目的基因表达量较低的植株即为基因沉默成功的植株。
[0019]本专利技术所述步骤(1)中，所述报告基因具体是指绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)，所述蝴蝶花转录组数据注释为目的基因的转录本保守区域，具体是指：蝴蝶花转录组数据注释为蝴蝶花八氢番茄红素脱氢酶PDS转录本保守区域。
[0020]本专利技术所述步骤(3)中进行侵染处理时，所用蝴蝶花植株是苗龄为1年生植株。
[0021]本专利技术所述步骤(3)中进行侵染处理时，侵染部位包括根状茎、茎尖或叶片；其中，(1)以根状茎和茎尖为侵染对象时，侵染前先用1ml注射器针头在根状茎或茎尖扎2
‑
3个孔，随后将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)蝴蝶花目的基因片段的克隆根据蝴蝶花转录组数据注释为目的基因的转录本保守区域设计酶切引物，并在正向和反向引物5
’
端分别添加限制性内切酶Xba I和Sac I的识别碱基，以及保护碱基序列GCTCTAGA和CGAGCTC；提取蝴蝶花RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得目的基因片段；电泳，切胶回收PCR产物；连接pEASY
‑
blunt载体，转化大肠杆菌DH5α感受态；37℃暗培养过夜后挑取单克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性；(2)构建含蝴蝶花目的基因TRV载体的根癌农杆菌提取步骤(1)中经测序验证的含有蝴蝶花目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒；使用Xba I和Sac I两个限制性内切酶对该克隆载体质粒和pTRV2质粒进行酶切，酶切条件37℃、40分钟；电泳、切胶回收目的基因和pTRV2载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将目的基因和pTRV2载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃、3小时；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，37℃暗培养过夜后挑取单克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物pTRV2
‑
F和pTRV2
‑
R进行阳性单克隆PCR检测并测序；提取获得的阳性克隆质粒，使用冻融法转化农杆菌GV3101，28℃暗培养两天后挑取单克隆，使用pTRV2
‑
F和pTRV2
‑
R引物进行阳性单克隆PCR检测；(3)以农杆菌介导侵染蝴蝶花植株将含有pTRV1、pTRV2、pTRV2
‑
报告基因、pTRV2
‑
目的基因片段的农杆菌GV3101菌液50
‑
100μL加入至5mL含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的Luria
‑
Bertani培养液，放入摇床中28℃、200rpm摇菌16小时，再转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、10mM MES和20μM AS的150ml LB液体培养基，放入摇床中28℃、200rpm摇菌16小时；当菌液的OD
600
为1.5
‑
2.0时，4000rpm、25℃离心10分钟收集菌体；用含有10mM MgCl2、10mM MES...

【专利技术属性】
技术研发人员：许曈，张润龙，邵灵梅，王小斌，李丹青，张佳平，夏宜平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：