一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选单拷贝T

【技术实现步骤摘要】
一种筛选单拷贝T
‑
DNA转基因植株的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及一种筛选单拷贝T
‑
DNA 转基因植株的方法。

技术介绍

[0002]农杆菌介导的植物遗传转化(Agrobacterium
‑
mediated transformation)依赖于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)所拥有的Ti质粒(tumor inducingplasmid)。Ti质粒包含一段位于两个短序列LB(left border)和RB(right border) 之间的T
‑
DNA序列(Transfer DNA)，T
‑
DNA能随农杆菌侵染植物而进入宿主细胞并整合到植物基因组中。Ti质粒除了T
‑
DNA之外，还编码一些毒蛋白(Vir 区，图1)。毒蛋白作为反式因子协助农杆菌侵染植物并实现T
‑
DNA的转移和整合。在野生的根癌农杆菌的Ti质粒上，T
‑
DNA基因编码的蛋白能够促使植物细胞不断分裂，引发根癌。Ti质粒的发现以及改造是植物遗传转化技术的重要发展。Ti质粒的改造包括将T
‑
DNA内原有基因删除后并不影响植物遗传转化。这使得我们能够将目标基因插入T
‑
DNA，而实现转基因。此外，将Ti质粒上编码反式因子的区域和T
‑
DNA区域分别安置在两个质粒上(二元载体和辅助载体)，而构建成的二元载体(binary vector)系统，促进了利用农杆菌进行植物遗传转化的应用(图1)。
[0003]尽管二元载体系统为植物遗传转化提供了很大的便利，但研究也表明二元载体介导的植物遗传转化也存在诸多问题。其中，多拷贝T
‑
DNA插入和T
‑
DNA序列之外的载体骨架序列的整合会导致基因表达不稳定以及使得相关的基因功能分析变得复杂。所以，寻找单拷贝的T
‑
DNA转基因植株是植物转基因育种以及基因功能分析的重要目的。目前，用于筛选单拷贝转基因植株的方法有Southern 杂交(Southern blot)(例如中国专利CN102533864A公开了获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法)，竞争性PCR(competitive PCR)(例如中国专利CN113046471A公开了一种基于竞争型PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法)，实时定量PCR(real
‑
time qPCR)和微滴数字PCR(digital drop PCR) 等。
[0004]传统的Southern杂交操作步骤繁琐、费时。竞争性PCR对内标物的构建要求高，有一定的局限性。微滴数字PCR则存在成本高，通量有限，操作繁琐等不足。实时定量PCR在时间、成本、灵敏度等因素上具有突出的优势，但是实时定量PCR的拷贝数分析依赖于相对Ct的计算，即用参考基因进行校正获得ΔCt，并与对照样品进行比较获得ΔΔCt值，在此基础上计算2
‑
ΔΔCt
获得拷贝数的变化。多步计算极大地放大了误差，从而无法区分拷贝数的两倍差异。因此目前虽然存在多种检测单拷贝转基因植株的方法，但是还缺少操作简单且可靠的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于实时定量PCR，利用Ct值相对变化筛选单拷贝T
‑
DNA转基因植株的方法。
[0006]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0007]一种筛选单拷贝T
‑
DNA转基因植株的方法，包括如下步骤：
[0008]S1.从待测植物基因组中选择一对参考序列R1和R2，再从相应的二元载体上选择T
‑
DNA序列，针对上述R1、R2、T
‑
DNA序列设计实时定量PCR引物，使已知转基因拷贝数为2的标准植株的R1和R2的Ct值相差约1(Ct
R1
<Ct
R2
)，且T
‑
DNA序列的Ct值介于R1和R2之间，即构成R1‑
T
‑
R2的Ct值关系；
[0009]S2.从待测的T1代T
‑
DNA转基因植株中挑选不含载体骨架序列的cleanT
‑
DNA植株；
[0010]S3.提取cleanT
‑
DNA植株基因组DNA，酶切基因组DNA解开反向串联T
‑
DNA结构；
[0011]S4.以酶切处理后的基因组DNA为模板，利用步骤S1设计的实时定量PCR引物进行扩增，获得稳定的Ct值；
[0012]S5.根据Ct值关系进行判断，若Ct值关系为R1‑
R2‑
T，则检测植株为单拷贝转基因植株；若为R1‑
T
‑
R2，则为双拷贝转基因植株；若为T
‑
R1‑
R2，则为多拷贝转基因植株。
[0013]本专利技术通过植物基因组中一对单拷贝参考扩增片段(R1，R2)和T
‑
DNA(T)扩增的Ct值在双拷贝植株中构成夹心关系(R1‑
T
‑
R2)；双拷贝T
‑
DNA植株的Ct值介于R1和R2间，形成三明治式的R1‑
T
‑
R2的夹心Ct关系。单拷贝相对双拷贝植株，其T
‑
DNA扩增Ct值增大约1，其Ct值移出夹心关系，而产生R1‑
R2‑
T的Ct模式；通过比较不同Ct值关系找出单拷贝T
‑
DNA转基因植株。本专利技术利用夹心Ct实时定量PCR，SCPCR(sandwichedCtreal
‑
timePCR)技术发现了T
‑
DNA整合的两个规律，即反向串联T
‑
DNA整合会严重影响拷贝数的检测；单拷贝T
‑
DNA整合集中在无载体骨架序列的植株中，再结合SCPCR技术和这两个发现，针对常用二元载体开发了一套完整的寻找农杆菌介导的单拷贝T
‑
DNA转基因植株的方法，通过先解开反向串联T
‑
DNA结构，再从T1群体中挑选cleanT
‑
DNA植株后再进行SCPCR，大大提高了寻找单拷贝转基因植株的效率。本专利技术方法适用于拟南芥、水稻、玉米等植物的单拷贝T
‑
DNA转基因植株。
[0014]优选地，所述单拷贝参考序列R1和R2的Ct值相距0.95～1.05(约1)。本专利技术在满足实时定量PCR引物扩增效率介于90％
‑
105％的前提下，可通过调节PCR扩增长度以及优化PCR扩增条件，使R1和R2的Ct值相距约1。
[0015]优选地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选单拷贝T
‑
DNA转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.从待测植物基因组中选择一对参考序列R1和R2，再从相应二元载体上选择T
‑
DNA序列，针对上述R1、R2、T
‑
DNA序列设计实时定量PCR引物，使已知转基因拷贝数为2的标准植株的R1和R2的Ct值相差约1、Ct
R1
<Ct
R2
，且T
‑
DNA序列的Ct值介于R1和R2之间，即构成R1‑
T
‑
R2的Ct值关系；S2.从待测的T1代T
‑
DNA转基因植株中挑选不含载体骨架序列的cleanT
‑
DNA植株；S3.提取clean T
‑
DNA植株基因组DNA，酶切基因组DNA解开反向串联T
‑
DNA结构；S4.以酶切处理后的基因组DNA为模板，利用步骤S1设计的实时定量PCR引物进行扩增，获得稳定的Ct值；S5.根据Ct值关系进行判断，若Ct值关系为R1‑
R2‑
T，则检测植株为单拷贝转基因植株；若为R1‑
T
‑
R2，则为双拷贝转基因植株；若为T
‑
R1‑
R2，则为多拷贝转...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡宇飞，陈晓静，黄吉雷，庄楚雄，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：