一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用。所述沼泽红假单胞菌中包括含crtC基因片段的上下游同源臂的重组质粒、含启动子PcbbG的重组质粒以及含操纵子MVAzp的重组质粒。本发明专利技术通过自杀质粒pJQ200SK介导的同源重组策略敲除沼泽红假单胞基因组中的crtC，首先得到了番茄红素产量提高了10倍的工程菌株，又在此基础上，通过穿梭质粒pMG103外源表达来自玉米黄素副球菌的MVA途径基因，最终得到了一株高产番茄红素的沼泽红假单胞工程菌株

【技术实现步骤摘要】
一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程和分子生物学
，具体涉及一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]番茄红素是萜烯化合物中的一种不饱和烯烃，也是类胡萝卜素中的一种纯天然色素，广泛应用于医药、化妆品、动物饲料和食品染色剂等领域。近几年，随着合成生物学技术的不断成熟，以微生物作为宿主合成番茄红素的研究成为热点。但目前制备过程中仍存在原材料的短缺导致成本较高、在生产过程中造成的环境污染等问题，因此还是需要一种环境友好型且经济可持续的番茄红素合成方法。
[0003]沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）是一种典型的紫色非硫细菌（PNSB），属于变形菌门、红螺菌科、红假单胞菌属。在自然界中的分布非常广泛，主要集中在光照充足的厌氧环境，分布范围包括沼泽、土壤、湖泊和大海等。沼泽红假单胞菌目前研究的热点主要是在废水处理和水产养殖领域的应用：因富含多种营养物质可以作为饲料添加剂；还可以提高水体含氧量，稳定pH，通过净化水质；降解动植物和工业中的废弃物。
[0004]但是，R. palustris在合成萜烯化合物领域可能有较大的潜能：1）R. palustris存在多种代谢方式：光合自养、光合异养、化能自养和化能异养，可以利用太阳能和大气中的二氧化碳进行生长，以产生所需的产物，来提供自身所需的能量。2）通过R. palustris的全基因组测序结果，找到了合成萜烯化合物前体的MEP途径基因和下游合成类胡萝卜素的基因，适合于合成萜烯化合物的研究。3）R. palustris的发酵过程和发酵条件进行的优化已被研究多年，加上其细胞结构简单，提取相对容易。因此，以R. palustris作为宿主生产合成萜烯化合物是具有潜力的，但目前还是没有将R. palustris作为宿主用来生产番茄红素的相关研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用。本专利技术首先通过自杀质粒pJQ200SK敲除沼泽红假单胞菌crtC，然后引入来自玉米黄素副球菌的外源MVAzp途径，从而提高了沼泽红假单胞菌合成番茄红素的能力。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌，所述沼泽红假单胞菌包括含crtC基因片段的上下游同源臂的重组质粒、含启动子PcbbG的重组质粒以及含操纵子MVAzp的重组质粒。
[0007]进一步的，所述crtC基因片段的上下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其源于沼泽红假单胞菌。
[0008]进一步的，所述启动子PcbbG的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0009]进一步的，所述操纵子MVAzp的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，其来源于玉米黄
素副球菌。
[0010]本专利技术还提供了所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌的构建方法，具体包括以下步骤：（1）扩增crtC基因片段的上下游同源臂，并将所述上下游同源臂连接起来，得到的产物与自杀质粒pJQ200SK分别进行酶切、连接、转化到感受态细胞中，得到重组质粒pJQ200SK
‑△
crtC；（2）将阳性重组质粒pJQ200SK
‑△
crtC转化至野生型沼泽红假单胞菌中，经抗性筛选、测序验证后，得到工程菌株
△
crtC；（3）扩增启动子PcbbG，将扩增产物与质粒pMG103进行无缝连接，转化至感受态细胞，得到重组质粒pMG103
‑
PcbbG；（4）扩增操纵子MVAzp，将扩增产物与重组质粒pMG103
‑
PcbbG进行无缝连接，转化至感受态细胞，得到重组质粒pMG103
‑
PcbbG
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MVAzp；（5）将阳性重组质粒pMG103
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PcbbG
‑
MVAzp转化至工程菌株
△
crtC中，经抗性筛选、测序验证后，得到工程菌株
△
crtC/pMG103
‑
PcbbG
‑
MVAzp，即为所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌。
[0011]进一步的，所述步骤（3）中的质粒pMG103为去掉启动子lac的质粒。
[0012]进一步的，所述抗性筛选的步骤为：将转化后的菌株30℃培养，长出的单菌落划线在含有庆大霉素的抗性平板上继续培养，再从抗性平板上挑6个单菌落划线在两个不含庆大霉素抗性却含10%蔗糖的平板上，每个平板分三个区域；从不含庆大霉素的10%蔗糖平板上再选多个单菌落，分别在不含庆大霉素抗性的10%蔗糖平板和含庆大霉素抗性的10%蔗糖平板上划线，若后者有菌落，前者没有，则菌株通过抗性筛选。
[0013]进一步的，所述自杀质粒除选用pJQ200SK外，还能够选择pOJ260、pDM4、pRE112以及其他的自杀质粒。
[0014]进一步的，所述质粒pMG103是穿梭质粒，还能够选择pBBRMCS
‑
5以及其他具有相同的功能的质粒来替换质粒pMG103。
[0015]本专利技术还提供了所述的沼泽红假单胞菌在用于生产番茄红素和/或提高番茄红素含量中的应用。
[0016]进一步的，所述沼泽红假单胞菌的使用方法为：（1）挑取沼泽红假单胞菌的单克隆到培养基中，加入碳源和抗生素，30
°
C培养，获得种子液；（2）将种子液按5%
‑
10%的接种量转接至培养基中，加入碳源，30
°
C培养，使用紫外分光光度计测定OD在660nm处的吸光光度值，直到OD不再变化，离心收集菌体；（3）向菌体中加入提取剂，放置在培养仪中震荡，每隔5min
‑
10min用针尖戳碎沉淀，直至细胞沉淀变白色，在此过程中，装有菌体的容器外包裹一层锡箔纸，防止番茄红素降解；离心，取上清，过滤后的液体中含有番茄红素，再利用HPLC检测番茄红素的产量。
[0017]进一步的，所述HPLC检测番茄红素产量的条件为：HPLC系统采用Thermo Ultimate 3000高效液相，色谱柱为4.6 x 250 mm，5 μm的 ZORBAX Eclipse Plus C
18
柱，检测器为UV检测器；柱温箱温度25 ℃；检测器波长为475 ℃；流动相为A：85%甲醇，B：15%乙酸乙酯；进样体积10 μL，流动相流速：1ml/min；流动相程序为：85%甲醇，15%乙酸乙酯，持续30min。
[0018]进一步的，所述碳源包括醋酸钠、苹果酸钠、琥珀酸钠、苯甲酸钠、甘油、NaHCO3和CO2中的至少一种，其浓度为20 mM。
[0019]进一步的，所述提取机为体积比为1：1的甲醇和丙酮的混合液。
[0020]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌，其特征在于：所述沼泽红假单胞菌包括含crtC基因片段的上下游同源臂的重组质粒、含启动子PcbbG的重组质粒以及含操纵子MVAzp的重组质粒。2.根据权利要求1所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌，其特征在于：所述crtC基因片段的上下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其源于沼泽红假单胞菌。3.根据权利要求1所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌，其特征在于：所述启动子PcbbG的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。4.根据权利要求1所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌，其特征在于：所述操纵子MVAzp的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，其来源于玉米黄素副球菌。5.权利要求1
‑
4任一项所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：（1）扩增crtC基因片段的上下游同源臂，并将所述上下游同源臂连接起来，得到的产物与自杀质粒pJQ200SK分别进行酶切、连接、转化到感受态细胞中，得到重组质粒pJQ200SK
‑△
crtC；（2）将阳性重组质粒pJQ200SK
‑△
crtC转化至野生型沼泽红假单胞菌中，经抗性筛选、测序验证后，得到工程菌株
△
crtC；（3）扩增启动子PcbbG，将扩增产物与质粒pMG103进行无缝连接，转化至感受态细胞，得到重组质粒pMG103
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PcbbG；（4）扩增操纵子MVAzp，将扩增产物与重组质粒pMG103
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PcbbG进行无缝连接，转化至感受态细胞，得到重组质粒pMG103
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PcbbG
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MVAzp；（5）将阳性重组质粒pMG103
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PcbbG
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MVAzp转化至工程菌株
△
crtC中，经抗性筛选、测序验证后，得到工程菌株
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crtC/pMG103
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PcbbG
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨建明，李美洁，夏青青，聂庆娟，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：