高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法技术

本发明专利技术提供了AAV衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含对VP3区中表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之一或其组合的修饰。本发明专利技术还提供了含有本发明专利技术之AAV衣壳蛋白的rAAV病毒体以及编码本发明专利技术之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与野生型rAAV载体和病毒体相比，本发明专利技术的rAAV载体和病毒体具有提高的转导多种目的细胞、组织和器官的效率。组织和器官的效率。组织和器官的效率。

【技术实现步骤摘要】
高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法
[0001]本申请是申请日为2013年5月15日、申请号为“201380034940.6”、专利技术名称为“高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2013/041234的中国国家阶段申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2013年3月15日提交的美国专利申请No.13/840,224(未决)和于2012年5月15日提交的美国临时专利申请No.61/647,318(未决)的优先权权益。本申请还涉及于2009年12月31日提交的美国专利申请No.12/595/196(于2013年5月21日授权为U.S.8,445,267)、于2008年4月8日提交的国际专利申请No.PCT/US2008/059647(进入国家)、于2007年4月9日提交的美国临时专利申请No.60/910,798(期满)、于2013年3月29日提交的美国专利申请No.13/854,011(未决)和于2013年4月2日提交的美国专利申请No.13/855,640(未决)。上述各申请各自的内容均在此通过专门引用以其整体并入。
[0004]关于联邦政府资助的研究或开发的声明
[0005]不适用。


[0006]本申请涉及高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法。

技术介绍

[0007]通过使用病毒来递送治疗性遗传物质，在基因治疗领域中已取得了重大进步。由于其低免疫原性以及能够有效地转导非分裂细胞，腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)作为用于基因治疗的高效病毒载体已引起了相当大的关注。已显示，AAV感染多种类型的细胞和组织，并且在过去十年内，使这种病毒系统适用于人基因治疗已经取得了显著进展。
[0008]在其正常“野生型”形式中，重组AAV(rAAV)DNA以长度约为4600个核苷酸(nt)的单链分子被包装进病毒衣壳中。通过病毒感染细胞后，细胞的分子机制将单DNA链转化成双链形式。
[0009]AAV具有很多特性，这些特性有利于将其用作基因递送载体：1)野生型病毒不与任何病理性人状况(condition)相关；2)重组形式不含天然病毒编码序列；以及3)在很多应用中已经观察到持久的转基因表达。基因治疗的主要障碍之一(即诱导针对载体来源的和转基因来源之表位的细胞免疫应答中的免疫竞争)，可通过复制缺乏和缺乏由重组AAV表达的病毒蛋白质来克服。
[0010]重组腺相关病毒载体的转导效率在体外和体内的不同细胞和组织中变化很大。已进行了系统性研究来阐明AAV生活周期中的基本阶段。例如，据记载，被表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR
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PTK)在酪氨酸残基处磷酸化的细胞蛋白质FKBP52在体外和体内均抑制AAV第二链DNA合成，从而抑制转基因表达。还已证明，EGFR
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PTK信号转导调节泛素/蛋白酶体途径介导的细胞内运输以及FKBP52介导的AAV载体第二链DNA的合成。在这些研究
中，抑制EGFR
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PTK信号转导导致AAV衣壳蛋白的泛素化降低，其转而通过限制蛋白酶体介导的AAV载体的降解来促进核转运，表明EGFR
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PTK介导的AAV衣壳上酪氨酸残基的磷酸化。

技术实现思路

[0011]本专利技术提供了AAV衣壳蛋白，其包含对VP3区中表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之一或其组合的修饰。本专利技术还提供了包含本专利技术之AAV衣壳蛋白的rAAV病毒体以及编码本专利技术之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与野生型rAAV载体和病毒体相比，本专利技术的rAAV载体和病毒体具有提高的转导多种目的细胞、组织和器官的效率。
[0012]在一个实施方案中，本专利技术提供了含有编码AAV衣壳蛋白之核苷酸序列的核酸分子，其中所述AAV衣壳蛋白的VP3区包含对应于野生型AAV衣壳蛋白[例如，SEQ ID NO：l、SEQ ID NO：2、SEQ 1D NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10；在一个实施方案中，优选野生型AAV2的衣壳蛋白(SEQ ID NO：2)]之VP3区中的赖氨酸残基位置上的非赖氨酸残基，其中野生型AAV蛋白质之VP3区中的赖氨酸残基是K258、K321，K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665和K706中的一个或更多个，或其任意组合。
[0013]在一个实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之K532的表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在一个实施方案中，将AAV衣壳中表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸(E)或精氨酸(R)。在一些特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之K532的表面暴露的赖氨酸残基变更为精氨酸(K532R)。
[0014]在某些实施方案中，对对应于野生型AAV2衣壳序列之K490、K544、K549和K556的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在某些特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之K490、K544、K549和K556的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸(E)。
[0015]在一个实施方案中，本专利技术提供了AAV2载体，其中将对应于野生型AAV2衣壳之K544和K556残基的表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸(E)。
[0016]在某些实施方案中，对对应于野生型AAV8衣壳序列之K530、K547和K569的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基进行修饰。在某些特定实施方案中，将对应于野生型AAV2衣壳序列之K530、K547和K569的一个或更多个表面暴露的赖氨酸残基变更为谷氨酸(E)。
[0017]在一个实施方案中，对AAV衣壳之表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基的组合进行修饰，其中修饰发生在对应于野生型AAV衣壳序列[例如，SEQ ID NO：1
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10中的一个或更多个；并且在一个特定实施方案中，为野生型AAV2的衣壳蛋白序列(SEQ IDNO：2)]之
[0018](Y444F+Y500F+Y730F+T491V)
[0019](Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V)
[0020](Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T659V)
[0021](T491V+T550V+T659V)
[0022](Y440F+Y500F+Y730F)
[0023](Y444F+Y500F+Y730F+T491V+S662V)，和/或
[0024](Y444F+Y500F+Y730F+T491V+T550V+T659V)
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AAV VP3蛋白，其包含：(a)对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之K258、K321、K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655、K665或K706位置上的非赖氨酸氨基酸残基；(b)对应于SEQ ID NO：8的野生型AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的非赖氨酸氨基酸残基；(c)对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之S261、S264、S267、S276、S384、S458、S468、S492、S498、S578、S658、S662、S668、S707或S721位置上的非丝氨酸氨基酸残基；(d)对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之T251、T329、T330、T454、T455、T503、T550、T592、T581、T597、T491、T671、T659、T660、T701、T713或T716位置上的非苏氨酸氨基酸残基；和/或(e)对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704或Y730位置上的非酪氨酸氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之K459、K490、K532、K544或K556位置上的非赖氨酸氨基酸残基。3.根据权利要求1或2所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：8的野生型AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的非赖氨酸氨基酸残基。4.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之K544和K566位置上的非赖氨酸氨基酸残基。5.根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其中所述非赖氨酸氨基酸残基选自谷氨酸(E)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或异亮氨酸(I)。6.根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之K258、K321、K459、K490、K507、K527、K572、K532、K544、K549、K556、K649、K655或K706 位置上的谷氨酸(E)氨基酸残基。7.根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之K544和K566位置上的谷氨酸(E)氨基酸残基。8.根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：8的野生型AAV8衣壳蛋白之K530、K547或K569位置上的谷氨酸(E)氨基酸残基。9.根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其包含对应于SEQ ID NO：2的野生型AAV2衣壳蛋白之S662位置上的非丝氨酸氨基酸残基。10.根据前述权利要求中任一项所述的AAV VP3蛋白，其中所述非丝氨酸氨基酸残基选自缬氨酸(...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿伦，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：