RNA中m5C和m6A双重分析逻辑光电化学传感方法技术

本发明专利技术属于生物基因技术领域，公开了一种RNA中m5C和m6A双重分析逻辑光电化学传感方法，RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法包括构建H型纳米支架；进行DNA步行器的构建；进行DNA折纸的构建；进行电极表面修饰和光电信号检测。本发明专利技术检测灵敏度高，具有临床实验室推广应用前景；不同浓度的m5C靶序列不影响m6A靶序列的光电信号；当不同浓度的m6A靶序列与10

【技术实现步骤摘要】
RNA中m5C和m6A双重分析逻辑光电化学传感方法


[0001]本专利技术属于生物基因
，尤其涉及一种RNA中m5C和m6A双重分析逻辑光电化学传感方法。

技术介绍

[0002]目前，RNA甲基化是RNA转录后最主要的表观遗传修饰方式，RNA甲基化包括N6
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甲基腺嘌呤m6A、N7
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甲基鸟嘌呤m7G、5
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甲基胞嘧啶m5C、N1
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甲基腺嘌呤m1A、假尿嘧啶Um等五种类型，其中m6A和m5C是发生最高频的两类修饰，而m6A叠合m5C(即特定RNA序列中腺嘌呤A和胞嘧啶C均同时发生甲基化修饰)占RNA甲基化比率≧95％。mRNA和lncRNA等非编码小RNA 通过甲基化修饰调控RNA的可变剪切、转录本组装和蛋白质翻译等；在肿瘤发生中，直接参与调节抑癌基因失活和癌基因表达。大量研究表明，m6A和m5C 修饰水平的偏倚与肿瘤、代谢性疾病、神经缺陷、心血管疾病和异常分化等密切相关。RNA甲基化分析已成为自身免疫性疾病、代谢性疾病等基因表观紊乱疾病临床诊断，和肿瘤早期预警与去甲基化治疗方案选择的新手段，RNA甲基化临床适宜检测技术研究具有重大意义。
[0003]依据检测原理不同，迄今已研究建立的RNA甲基化分析技术主要包括以下三类：
[0004]一是基于免疫共沉淀和全基因组测序建立的RNA甲基化测序分析 (MeRIP
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seq)：MeRIP
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seq分析是利用m6A和m5C特异性抗体筛选携带m6A 和m5C的mRNA片段并将其沉淀，构建相应的cDNA文库后进行高通量测序。该技术是目前唯一可实现甲基化定位和丰度分析以及甲基化碱基类别鉴定的 RNA甲基化检测技术。但由于该方法的分辨率仅约100个bp，测序长度受限，且易受跨越残基的大峰影响；另一方面，测试结果受测序深度的影响，文库构建过程复杂；同时，由于检测后庞大的数据处理和对检测设备的特殊要求，导致其难以在临床实验室推广应用。
[0005]二是基于高效液相色谱和质谱技术为基础建立的液相色谱
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串联质谱技术：即LC
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MS/MS，该技术可测定基因组RNA甲基化水平，能够对含痕量RNA的生物样本(如血浆)进行全RNA甲基化丰度的准确测定。但由于分析前需进行 RNA提取和多重洗脱，并需采用核酸外切酶将RNA水解为单核苷酸，因而存在检测过程繁冗、洗脱纯度干扰和酶解不完全等缺陷。
[0006]第三类是基于特定位点切割与夹板提取结合薄层色谱技术而构建的 SCARLET分析。SCARLET是一种整合了特定位点切割、放射性标记、夹板辅助提取以及薄层色谱等多种技术的RNA测序法。该类技术分辨率高，但由于涉及放射性污染，以及同样存在酶解效率和测序后庞大的数据处理等缺陷，而限制了其在临床医学实验室的开展。
[0007]光电化学传感技术是以电化学生物传感技术为研究背景，利用光学和电学信号转换作为基础，通过光电活性材料发生电荷转移所产生光电流信号响应的变化来实现对待测物灵敏检测的一种新型检测技术，其结合了电化学技术的传统优点和光电化学技术的优势，使用光学信号作为激发光源，产生较低的背景信号，对检测干扰小。同时，它还具有仪器操作简便、检测灵敏度高和易于实时监测等优点，便于临床实验室推广使用，在生物化学、蛋白质组学和药物筛选等领域具有广阔的应用前景。
[0008]在疾病早期诊断中，一种位点甲基化指标并不具有代表性，往往需要通过多个指标联合诊断，这就需要建立灵敏、高效的多位点同时检测技术。目前国内外虽已有光电化学传感技术用于RNA甲基化定量分析的报道，但RNA中m5C 和m6A双重分析的光电化学传感技术未见报道。
[0009]因此，建立一种具有临床实验室推广应用前景的RNA甲基化分析技术，已成为代谢性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等基因表观紊乱疾病临床检测的迫切需求。
[0010]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0011](1)现有基于免疫共沉淀和全基因组测序建立的RNA甲基化测序分析技术，由于分辨率仅约100个bp，测序长度受限，且易受跨越残基的大峰影响；测试结果受测序深度的影响，文库构建过程复杂；同时，由于检测后庞大的数据处理和对检测设备的特殊要求，导致其难以在临床实验室推广应用。
[0012](2)现有基于高效液相色谱和质谱技术为基础建立的液相色谱
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串联质谱技术，由于分析前需进行RNA提取和多重洗脱，并需采用核酸外切酶将RNA水解为单核苷酸，因而存在检测过程繁冗、洗脱纯度干扰和酶解不完全等缺陷。
[0013](3)现有基于特定位点切割与夹板提取结合薄层色谱技术而构建的 SCARLET分析技术，由于涉及放射性污染，以及同样存在酶解效率和测序后庞大的数据处理等缺陷，而限制了其在临床医学实验室的开展。
[0014](4)目前国内外虽已有光电化学传感技术用于RNA甲基化定量分析的报道，但RNA中m5C和m6A双重分析的光电化学传感技术未见报道。
[0015]解决以上问题及缺陷的难度为：建立一种同时满足高灵敏、操作简便、干扰小、设备要求低、易于临床推广使用的分析RNA甲基化的技术是最大的难度。
[0016]解决以上问题及缺陷的意义为：m6A和m5C修饰水平的偏倚与肿瘤、代谢性疾病、神经缺陷、心血管疾病和异常分化等密切相关。RNA甲基化分析已成为自身免疫性疾病、代谢性疾病等基因表观紊乱疾病临床诊断，和肿瘤早期预警与去甲基化治疗方案选择的新手段，因此构建RNA甲基化临床适宜检测技术研究具有重大意义。

技术实现思路

[0017]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于肿瘤早期预警检测的双重分析的逻辑光电化学传感器，还涉及一种RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法。
[0018]本专利技术是这样实现的，一种用于肿瘤早期预警检测的双重分析的逻辑光电化学传感器，包括：
[0019]不同浓度的m5C靶序列与10
‑7M m6A靶序列共同孵育后的DNA步行器1，用于在同一根电极表面检测光电信号；
[0020]当不同浓度的m6A靶序列与10
‑7M m5C靶序列共同孵育后的DNA步行器2，用于在同一根电极表面检测光电信号。
[0021]所述DNA步行器1，用于在同一根电极表面检测的465nm波长下的光电信号；
[0022]所述DNA步行器2，用于在同一根电极表面检测的625nm波长下的光电信号。
[0023]本专利技术另一目的在于提供一种RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法，所述RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法包括以下步骤：
[0024]步骤一，构建H型纳米支架；
[0025]步骤二，进行DNA步行器的构建；
[0026]步骤三，进行DNA折纸的构建；
[0027]步骤四，进行电极表面修饰和光电信号检测。
[0028本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤早期预警检测的双重分析的逻辑光电化学传感器，其特征在于，所述用于肿瘤早期预警检测的双重分析的逻辑光电化学传感器包括：不同浓度的m5C靶序列与10
‑7M m6A靶序列共同孵育后的DNA步行器1，用于在同一根电极表面检测光电信号；当不同浓度的m6A靶序列与10
‑7M m5C靶序列共同孵育后的DNA步行器2，用于在同一根电极表面检测光电信号。2.如权利要求1所述的用于肿瘤早期预警检测的双重分析的逻辑光电化学传感器，其特征在于，所述DNA步行器1，用于在同一根电极表面检测的465nm波长下的光电信号；所述DNA步行器2，用于在同一根电极表面检测的625nm波长下的光电信号。3.一种利用权利要求1～2任意一项所述用于肿瘤早期预警检测的双重分析的.逻辑光电化学传感器的RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法，其特征在于，所述RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法包括以下步骤：步骤一，构建H型纳米支架；步骤二，进行DNA步行器的构建；步骤三，进行DNA折纸的构建；步骤四，进行电极表面修饰和光电信号检测。4.如权利要求3所述RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法，其特征在于，步骤一中，所述构建H型纳米支架，包括：用四条寡核苷酸序列构建H型纳米支架；配置TM杂交缓冲液，用该缓冲液稀释A、B、A1、B1，等比杂交使终浓度为2μM，快速退火得到H型结构，并用15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳在150V的电压下验证是否正确形成；其中，所述TM杂交缓冲液由10mM tris
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盐酸、1mM EDTA以及12.5mM氯化镁组成；所述退火，包括：于90℃10min，迅速退火到4℃持续0.5h以上，取出放入4℃储存备用；所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述B的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述A1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述B1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。5.如权利要求3所述RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法，其特征在于，步骤二中，所述DNA步行器的构建，包括：用链霉亲和素标记的Fe3O4磁珠作为支撑基体构建DNA步行器，生物素标记L1和S1链，将S1和outputA在37℃杂交2h形成双链结构；用结合缓冲液清洗磁珠三次，将磁珠重悬于结合缓冲液中，将L1和S1/outputA按照一定比例加入一定量的磁珠中，37℃振荡混合40min，使磁珠与L1和S1充分反应结合，并用TM缓冲液清洗备用；L2、S2和磁珠的连接体的制备方法同理。6.如权利要求5所述RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法，其特征在于，所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述S1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述outputA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述L2的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述S2的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。7.如权利要求3所述RNA中m5C和m6A双重分析的逻辑光电化学传感方法，其特征在于，步骤三中，所述DNA折纸的构建，包括：
用XA，XB，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑峻松，朱全敬，李艳，方立超，李承红，邓均，黄辉，刘华敏，汪莉娜，刘飞雪，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：