【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴定免疫调节基因的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2018年11月30日提交的美国临时专利申请第62/773,767号和于2019年9月23日提交的美国临时专利申请第62/904,283号的权益，这些申请的每个的公开内容在此通过引用以其整体并入。
[0003]序列表
[0004]本申请包括序列表，所述序列表已以ASCII格式电子地提交并且通过引用特此以其全文并入。于2019年11月13日生成的所述ASCII副本被命名为47533
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743_601_SL.txt并且大小为1,234字节。
[0005]背景
[0006]针对癌细胞的免疫应答对于限制癌症的生长或扩散可以是重要的。然而，一些癌细胞可以负面调节免疫应答，这可以有助于癌细胞的存活和扩散。免疫应答可以通过涉及免疫调节基因的机制被下调。免疫调节基因的鉴定可以导致对于癌症、自身免疫性疾病等的新治疗的开发。然而，需要新的鉴定免疫调节基因的高通量方法。
[0007]概述
[0008]在一方面，本文描述了筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a)在免疫细胞的多于一个单独群体中表达外源细胞受体或其功能片段，其中每个群体包含多于一个免疫细胞；b)将CRISPR系统引入所述免疫细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：i)指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii)外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化免疫细胞...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a.在免疫细胞的多于一个单独群体中表达外源细胞受体或其功能片段，其中每个群体包含多于一个免疫细胞；b.将CRISPR系统引入所述免疫细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：i.指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii.外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化免疫细胞的多于一个单独群体，所述工程化免疫细胞的单独群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；c.进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化免疫细胞与表达所述外源细胞受体或其功能片段的同源抗原的多于一个细胞接触；并且d.从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体的影响。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个的细胞溶解活性水平。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个的增殖水平。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述读取包括确定由所述工程化免疫细胞的多于一个单独群体中的每一个表达的因子水平。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述因子是蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白由所述工程化免疫细胞群体分泌。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述蛋白是细胞因子或趋化因子。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白是细胞表面蛋白。11.根据权利要求6
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10中任一项所述的方法，其中所述表达通过流式细胞术、蛋白质印迹或ELISA来确定。12.根据前述权利要求所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的免疫细胞包含所述基因组破坏。13.根据权利要求12所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少80％的免疫细胞包含所述基因组破坏。14.根据权利要求12所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少90％的免疫细胞包含所述基因组破坏。15.根据权利要求12
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14中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述免疫细胞百分比通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析来确定。16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到所述免疫
细胞的多于一个单独群体的基因组中。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到编码内源细胞受体的内源基因序列中。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到安全港位点中。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。20.根据权利要求16所述的方法，其中所述外源细胞受体被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。21.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。22.根据权利要求21所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少70％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。23.根据权利要求21所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少80％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。24.根据权利要求21所述的方法，其中在没有选择步骤的情况下，所述免疫细胞的单独群体中的每一个的至少90％的免疫细胞表达所述外源细胞受体。25.根据权利要求21
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24中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个的所述免疫细胞百分比通过流式细胞术或测序来确定。26.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述基因组破坏是双链断裂。27.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述核酸酶使用电穿孔引入。28.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述核酸酶是内切核酸酶。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx1S、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述内切核酸酶是Cas9。31.根据前述权利要求所述的方法，其中所述指导核酸是指导核糖核酸(gRNA)。32.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述指导核酸包括硫代磷酸酯(PS)连接、2
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氟(2
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F)修饰、2
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O
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甲基(2
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O
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Me)连接、2
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O
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甲基3硫代磷酸酯连接、S
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约束乙基(cEt)修饰或其任何组合。33.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述指导核酸使用电穿孔引入。34.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述外源细胞受体使用电穿孔引入。35.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中所述外源细胞受体使用病毒载体引入。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：重组AAV(rAAV)载体、杂合AAV载体、嵌合AAV载体、自身互补AAV(scAAV)载体、修饰的AAV载体及其任
何组合。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述AAV载体是嵌合AAV载体。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述嵌合AAV载体包含至少一个AAV衣壳基因序列中的修饰。40.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述外源细胞受体是T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、NK细胞受体、树突细胞受体、单核细胞受体、巨噬细胞受体、中性粒细胞受体、嗜酸性粒细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述外源细胞受体是T细胞受体(TCR)。42.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述单个基因是免疫调节基因。43.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述单个基因是候选免疫检查点基因。44.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法还包括冷冻保存所述工程化免疫细胞的单独群体。45.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法还包括处理所述读取以鉴定候选免疫调节基因。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述处理包括由以下至少一项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述处理包括由以下至少两项、三项、四项、五项、六项、七项或八项确定标准：细胞溶解活性、所述候选免疫调节基因的基因表达、由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的细胞内定位、所述候选免疫调节基因与人类疾病相关的功能丧失、与所述候选免疫调节基因的一部分结合的指导核酸的指导核酸评分、开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、靶向所述候选免疫调节基因的现有药物、或所述候选免疫调节基因的功能丧失表型或其任何组合。48.根据权利要求46所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少一种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。49.根据权利要求47所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少两种候选免疫调节基因进行排序，以产生排序的候选免疫调节基因。50.根据权利要求46或48所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少一种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。51.根据权利要求47或49所述的方法，其中所述处理包括根据所述至少两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种标准对至少10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、5000种、10000种、50000种或100000种候选免疫调节基因进行排序。52.根据权利要求48或49所述的方法，所述方法还包括选择所述排序的候选免疫调节
基因的前10种、20种、30种、40种或50种，从而产生排序的输出。53.根据权利要求52所述的方法，所述方法还包括从所述排序的输出中鉴定基因家族、基因功能或细胞内信号传导通路中的至少一种，从而产生分析的排序的输出。54.根据权利要求53所述的方法，所述方法还包括关联所述分析的排序的输出的细胞溶解活性，从而产生细胞溶解相关联的排序的输出。55.根据权利要求54所述的方法，所述方法还包括根据由所述候选免疫调节基因编码的蛋白的所述细胞内定位，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。56.根据权利要求54所述的方法，所述方法还包括根据所述开发中的靶向所述候选免疫调节基因的现有药物和所述针对所述候选免疫调节基因的现有药物，对来自所述细胞溶解相关联的排序的输出的所述候选免疫调节基因进行排序。57.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个T细胞。59.根据权利要求58所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD8+T细胞。60.根据权利要求58所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+T细胞。61.根据权利要求58所述的方法，其中所述多于一个T细胞包括多于一个CD4+T细胞和多于一个CD8+T细胞。62.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个人类细胞。63.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个原代细胞。64.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的每一个包括多于一个离体细胞。65.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述免疫细胞的多于一个单独群体包括免疫细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。66.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的所述每一个包含编码改善所述工程化免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的转基因。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述转基因被整合在所述工程化免疫细胞的基因组中。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述转基因被整合到安全港位点。69.根据权利要求68所述的方法，其中所述安全港位点是AAVS位点(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5或hROSA26。70.根据权利要求67所述的方法，其中所述转基因被整合到编码起所述多于一个免疫细胞的免疫应答的负调节因子作用的蛋白的基因的一部分中。
71.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述工程化免疫细胞群体中的所述每一个包含增强编码改善所述工程化免疫细胞的免疫调节功能的蛋白的基因表达的遗传修饰。72.根据权利要求71所述的方法，其中表达所述同源抗原的所述多于一个细胞是癌细胞。73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述癌细胞是原代癌细胞或来自癌细胞系。74.根据权利要求71
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73中任一项所述的方法，其中所述癌细胞包含至少一种基因中的基因组破坏。75.根据权利要求74所述的方法，其中所述基因组破坏由CRISPR系统介导，所述CRISPR系统包含与所述基因的一部分结合的gRNA和介导基因组DNA裂解的核酸酶。76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述基因组破坏是双链断裂。77.根据权利要求74
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76中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因编码是免疫应答的负调节因子的蛋白。78.根据权利要求77所述的方法，其中所述蛋白是检查点抑制剂的配体。79.根据权利要求78所述的方法，其中所述蛋白是选自由以下组成的组的检查点抑制剂的配体：程序性细胞死亡1(PD
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1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、白细胞介素10受体亚基α(IL10RA)、白细胞介素10受体亚基β(IL10RB)、腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V
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set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、B和T淋巴细胞相关因子(BTLA)、吲哚胺2,3
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双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三结构域长胞质尾区1(KIR3DL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C
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C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)、CD160分子(CD160)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD96分子(CD96)、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)、半胱天冬酶8(CASP8)、半胱天冬酶10(CASP10)、半胱天冬酶3(CASP3)、半胱天冬酶6(CASP6)、半胱天冬酶7(CASP7)、Fas相关死亡结构域(FADD)、Fas细胞表面死亡受体(FAS)、转化生长因子β受体II(TGFBRII)、转化生长因子β受体I(TGFBR1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD家族成员4(SMAD4)、SKI原癌基因(SKI)、SKI样原癌基因(SKIL)、TGFB诱导因子同源盒1(TGIF1)、血红素加氧酶2(HMOX2)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素6信号转导子(IL6ST)、c
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src酪氨酸激酶(CSK)、带有鞘糖脂微结构域1的磷酸蛋白膜锚(PAG1)、信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT1)、叉头框P3(FOXP3)、PR结构域1(PRDM1)、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(BATF)、可溶性鸟苷酸环化酶1α2(GUCY1A2)、可溶性鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)、可溶性鸟苷酸环化酶1β2(GUCY1B2)、脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)蛋白质家族或可溶性鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)、egl
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9家族缺氧诱导因子1(EGLN1)、egl
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9家族缺氧诱导因子2(EGLN2)、egl
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9家族缺氧诱导因子3(EGLN3)、蛋白磷酸酶1调节性亚基12C(PPP1R12C)、NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin 2(SIRT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(PTPN1)。80.根据权利要求72
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79中任一项所述的方法，其中所述癌细胞表达至少一种外源蛋
白。81.根据权利要求80所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面受体。82.根据权利要求80所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞内蛋白。83.根据权利要求80
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82中任一项所述的方法，其中编码所述外源蛋白的转基因被整合到所述癌细胞的基因组中。84.根据权利要求80
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83中任一项所述的方法，其中所述外源蛋白调节免疫细胞识别和/或杀伤所述癌细胞的能力。85.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。86.一种组合物，所述组合物包含免疫细胞的多于一个单独群体，其中免疫细胞的每个单独群体包含多于一个免疫细胞，所述多于一个免疫细胞i)表达外源细胞受体；和ii)包含CRISPR系统，所述CRISPR系统包含指导核酸和外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述免疫细胞的单独群体中的每一个是不同的。87.根据权利要求86所述的组合物，其中每个单独的群体的所述多于一个免疫细胞的所述群体包含所述单个候选基因中的基因组破坏。88.根据权利要求87所述的组合物，其中每个单独的群体的所述多于一个免疫细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因中的基因组破坏。89.根据权利要求86
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88中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞的单独群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。90.根据权利要求86
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88中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞的多于一个单独群体包括免疫细胞的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独群体。91.一种组合物，所述组合物包含多于一个单独的细胞群体，每个单独的细胞群体包含i)表达外源细胞受体的多于一个免疫细胞和ii)表达所述外源细胞受体的同源抗原的细胞；其中所述多于一个免疫细胞中的每一个包含单个候选基因的改变的基因组序列，并且其中所述单个候选基因对于所述单独的细胞群体中的每一个是不同的。92.根据权利要求91所述的组合物，其中每个单独的细胞群体的所述多于一个免疫细胞的至少70％、80％或90％包含所述单个候选基因的所述改变的基因组序列。93.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述单独的细胞群体中的每一个被包含在一个或更多个阵列的单独的区室中。94.根据权利要求91
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93中任一项所述的组合物，其中所述多于一个单独的细胞群体包括至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、5000个、10000个、50000个或1000000个单独的细胞群体。95.一种筛选多于一个单个候选基因的方法，所述方法包括：a.获得表达抗原的癌细胞的多于一个单独群体，其中每个群体包括多于一个癌细胞；b.将CRISPR系统引入所述癌细胞的单独群体中的每一个中，所述CRISPR系统包含：
i.指导核酸，所述指导核酸结合单个候选基因的一部分，其中所述单个候选基因对于所述癌细胞的单独群体中的每一个是不同的；和ii.外源核酸酶或编码所述外源核酸酶的核酸；从而产生工程化癌细胞的多于一个单独群体，所述工程化癌细胞包含所述单个候选基因中的基因组破坏，其中所述基因组破坏抑制所述单个候选基因的表达；c.进行体外测定，包括在体外使所述多于一个工程化癌细胞与表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的多于一个免疫细胞接触；并且d.从所述体外测定中获得读取，从而确定抑制所述单个候选基因的表达的所述基因组破坏对所述工程化癌细胞的多于一个单独群体或表达与所述抗原结合的细胞受体或其功能片段的所述免疫细胞的影响。96.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的细胞死亡水平。97.根据权利要求96所述的方法，其中所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。98.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述工程化癌细胞的单独群体中的每一个的一定百分比的细胞被杀伤的时间。99.根据权利要求98所述的方法，其中所述细胞死亡水平通过流式细胞术或显微术来确定。100.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述多于一个免疫细胞的细胞溶解活性水平。101.根据权利要求100所述的方法，其中所述细胞溶解活性水平通过铬释放测定、电阻抗测定、时差显微术或共培养测定来确定。102.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定所述多于一个免疫细胞的增殖水平。103.根据权利要求102所述的方法，其中所述增殖水平通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)测定、显微术、电阻抗测定或流式细胞术来确定。104.根据权利要求95所述的方法，其中所述读取包括确定由所述多于一个免疫细胞表达的因子水平。105.根据权利要求104所述的方法，其中所述因子是蛋白。106.根据权利要求105所述的方法，其中所述蛋白由所述工程化免疫细胞群体分泌。107.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述蛋白是细胞因子或趋化因子。108.根据权利要求104所述的方法，其中所述蛋白是细胞表面蛋白。109.根据权利要求104
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