rhFGF21融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其组合物及其用途制造技术

本申请公开了一种重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF21)融合蛋白、编码其的多核苷酸、重组表达载体、重组细胞、包含其的药物组合物和试剂盒、其用途及产生其的方法。本申请通过基因工程方法高效可溶性地表达得到rhFGF21-(VPGXG)

【技术实现步骤摘要】
rhFGF21融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其组合物及其用途


[0001]本申请属于生物医药领域，具体而言，涉及一种包含融合在一起的重组人成纤维细胞生长因子21蛋白(rhFGF21)与类弹性蛋白(VPGXG)
n
的融合蛋白、编码其的多核苷酸、重组表达载体和重组细胞、包含其的组合物、试剂盒及其用途和产生该融合蛋白的方法。

技术介绍

[0002]成纤维细胞生长因子21(FGF21)是主要由肝脏产生的新陈代谢调控因子，其在肥胖症和2型糖尿病动物模型中发挥有效的降糖和降脂作用。FGF21代谢作用的主要位点是脂肪组织、肝脏和胰腺。实验研究已显示，在对糖尿病小鼠和灵长类施用FGF21后，糖尿病代偿和血脂异常有改善。
[0003]但是，FGF21在体内循环半衰期非常短，进而达不到理想的药效。用聚乙二醇(PEG)修饰FGF21能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。然而，目前的PEG化FGF21存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制等弊端，在生产中增加了成本。因此，开发反应条件温和、步骤简单、快速、高效的位点特异性修饰方法对保证FGF21的药效尤为重要。
[0004]五肽重复序列单元是由五种氨基酸VPGXG组成的具有弹性功能和温度敏感性的多肽。X(即，Xaa)可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。它具有良好的生物相容性，但是针对不同蛋白，不同的循环数(即，VPGXG单元的重复次数)会对表达量、半衰期以及活性产生不同的影响。对于能保证FGF21活性并延长其半衰期的合适的弹性蛋白的循环数，目前尚未有报道，需要实验探究。
[0005]因此，需要开发出合适的融合蛋白以确保人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)活性并延长其半衰期，同时，还需要进一步开发出适合该融合蛋白的体外表达体系，以高效得到具有活性的融合蛋白。

技术实现思路

[0006]本申请针对rhFGF21的半衰期短、活性无法保证等在药用过程中存在的问题，专利技术人通过研究而提供一种新的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白。进一步地，专利技术人还开发了适合该融合蛋白的原核表达体系，从而能够以期望的效率实现rhFGF21融合蛋白的可溶性表达。
[0007]一个方面，本申请涉及一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)
n
，所述rhFGF21包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列；X为A和/或V；n为选自20-80中的整数。
[0008]另一方面，本申请涉及编码上述的融合蛋白的多核苷酸。
[0009]另一方面，本申请涉及含有编码上述的融合蛋白的多核苷酸的重组表达载体。
(VPGXG)
80
治疗组仍然表现出一定的治疗效果，且rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组的降糖效果最好。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0021]图5为示出口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的结果的图表。口服葡萄糖后30min，模型组的血糖水平显著上升，rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组的血糖水平显著低于模型组。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0022]图6为示出58天内各组小鼠的血糖的变化情况的图表。模型组小鼠的血糖始终维持较高的水平，rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组小鼠的血糖较模型组显著下降，治疗后血糖维持在较低的水平并接近正常组小鼠的血糖水平，且药效比rhFGF21更持久。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0023]图7为示出各组小鼠的血清胰岛素含量的图表。模型组小鼠的血清胰岛素含量显著下降，而rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组小鼠的血清胰岛素含量相较于模型组得到显著的提高。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0024]图8为示出各组小鼠的糖化血红蛋白水平的图表。给予相应的测试样品30天后，模型组小鼠的糖化血红蛋白含量维持在较高的水平，而rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组小鼠的糖化血红蛋白水平显著下降。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0025]图9为示出各组小鼠的肝脏内G6Pase基因的相对表达量的图表。模型组小鼠的肝脏内G6Pase表达量显著升高，而rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组小鼠的肝脏内G6Pase表达量显著下降。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0026]图10为示出各组小鼠的肝脏内PCK基因的相对表达量的图表。模型组小鼠的肝脏内PCK基因表达量显著升高，而rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组小鼠的肝脏内PCK基因表达量显著下降。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.01，与模型组相比；
#
p<0.05，
##
p<0.01，与正常组相比。
[0027]图11和图12为示出各组小鼠的肝脏内的G6Pase和PCK蛋白的表达量的图。模型组小鼠的肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著升高，而rhFGF21-(VPGXG)
40
治疗组小鼠的肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著下降。其中，
*
p<0.05，
**
p<0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)
n
，所述rhFGF21包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列；X为A和/或V；n为选自20-80中的整数。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，X为A和V，且A与V比例为(1-3):(1-3)、优选2:3；优选地，n为40-60中的整数、优选40；优选地，所述融合蛋白由融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)
n
以及任选的接头组成；更优选地，所述接头的氨基酸序列为RS和/或GS；优选地，所述融合蛋白具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的氨基酸序列。3.一种编码权利要求1或2所述的融合蛋白的多核苷酸；优选地，编码所述融合蛋白中的rhFGF21的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的核苷酸序列；优选地，编码所述融合蛋白中的接头的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5示出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸包含以SEQ ID NO:6示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少80％一致性的核苷酸序列。4.一种含有权利要求3所述的多核苷酸的重组表达载体；优选地，所述重组表达载体为原核重组表达载体；更优选地，所述重组表达载体为携带分子伴侣的原核重组表达载体；进一步优选地，所述分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白；或者进一步优选地，所述重组表达载体为重组的pSUMO载体或重组的PET系列载体。5.一种含有权利要求4所述的重组表达载体或者在其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸的重组细胞；优选地，用于构建所述重组细胞的宿主细胞为原核宿主细胞；更优选地，所述原核宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。6.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的融合蛋白；优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。7.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的融合蛋白或者权利要求6所述的药物组合物；优选地，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液；优选地，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液、优选50mmol/L-150mmol/L的精氨酸水溶液；优选地，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液；优选地，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液和pH 5.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖伟，李德山，于丹，刘芝航，王振中，尹成凯，孙旭，
申请(专利权)人：江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：