一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供的几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述几丁质酶的AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，本发明专利技术还提供了包含AfChi18基因的重组质粒以及用于表达所述重组质粒的重组菌株。本发明专利技术提供的几丁质酶为典型的几丁质内切酶，大小为40KDa，该几丁质酶的最适反应温度为45℃，在20℃～50℃范围内热稳定性好；最适pH为5.0，在pH4.0～6.0具有较高的酶活，表明本发明专利技术提供的几丁质酶具有较高的稳定性。的稳定性。的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程的
，尤其涉及一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用。

技术介绍

[0002]几丁质又称壳多糖(chitin)，分子式为[C8H
13
O5N]n
。为N
‑
乙酰葡糖胺(N
‑
acetyl
‑
D
‑
glcnac
‑
glucosamine)通过β
‑
1,4糖苷键连接聚合而成的结构同多糖，广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，虾壳中的几丁质含量为25％左右，从虾壳中提取甲壳素的成本低、产量高。几丁质作为一种重要的生物资源，在地球上含量仅次于纤维素，年自然生产量为10
11
吨，是一种巨大的可再生资源。近些年来，几丁质的绿色应用已经成为科研热点。
[0003]几丁质的降解产物是高附加值的几丁质寡糖、几丁质单糖及其对应衍生物等，具有抗微生物、抗氧化、基因治疗、免疫细胞增殖和肿瘤生长抑制的作用，作为添加剂被广泛应用于饲料和食品中。几丁质寡糖在现阶段的制备方法有化学提取法，壳寡糖乙酰化法。化学提取法一般使用的是酸水解法，利用强酸降解几丁质为氨基葡萄糖，经乙酰化后获得N
‑
乙酰氨基葡萄糖；或用稀酸直接降解几丁质生成几丁质寡糖。化学提取法反应剧烈，成本高，而且环境污染严重，几丁质寡糖产物聚合度低。为了迎合国家绿色可持续发展政策，生物酶法绿色降解几丁质现已成为科研热点。生物酶法降解几丁质制备几丁质寡糖，具有反应过程温和，生物活性好以及高效利用废弃物甲壳资源的优点。
[0004]几丁质酶按照糖苷键的切割方式可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶及N
‑
乙酰葡萄糖苷酶。内切几丁质酶可随机作用于几丁质长链的任何一个糖苷键，并将它水解成几丁质寡糖。外切几丁质酶与内切几丁质酶不同，其可从几丁质糖链非还原末端将几丁质降解为(GlcNAc)2。然而N
‑
乙酰葡萄糖苷酶不能直接作用于几丁质，只能将几丁质寡糖水解生成GlcNAc。几丁质酶将废弃物几丁质降解生成几丁质寡糖，反应条件温和，绿色环保及其原料低成本和高产出，完全符合工业生产要求。
[0005]因此，挖掘具有高酶活的新型几丁质酶和高效利用生物质多糖具有重要意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种几丁质酶，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]本专利技术还提供了一种编码所述几丁质酶的AfChi18基因，所述AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010]本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括编码所述几丁质酶的AfChi18基因的核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提供了一种重组菌株，所述重组菌株表达所述的重组质粒。
[0012]本专利技术还提供了一种所述几丁质酶的表达方法，包括如下步骤：
[0013](1)将AfChi18基因与质粒载体连接，得到重组质粒；
[0014](2)将所述重组质粒转化至克隆菌株，得到重组克隆菌株；
[0015](3)提取所述重组克隆菌株中的质粒，转化至表达菌株，得到重组表达菌株；
[0016](4)将重组表达菌株进行诱导培养，收集菌体破碎，得到几丁质酶。
[0017]优选的，所述AfChi18基因的扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
[0018]优选的，所述质粒载体为pET28a，所述克隆菌株为E.coli DH5α，所述表达菌株为E.coli BL21 DE
3 codonplus RIL。
[0019]优选的，步骤(5)中所述诱导培养是将重组表达菌株接入含有卡那霉素的第一LB培养基中在36～38℃下培养12～18h，再按照1％v/v的接种量接种至含卡那霉素的第二LB培养基中，在36～38℃下培养至OD
600
＝0.6～0.8，然后加入异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷，于25～30℃，180～200rpm下诱导8～10h。
[0020]优选的，所述第一LB培养基和第二LB培养基中卡那霉素的浓度独立地为48～52mg/ml；所述异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷在第二LB培养基中的终浓度为0.0008～0.0012M。
[0021]本专利技术还提供了一种所述的几丁质酶在降解几丁质方面的应用。
[0022]本专利技术提供的几丁质酶酶解胶体几丁质的产物主要为(GlcNAc)2和(GlcNAc)3，伴有少量的GlcNAc，为典型的几丁质内切酶，大小为40KDa。该几丁质酶的最适反应温度为45℃，在20℃～50℃范围内热稳定性好；最适pH为5.0，在pH4.0～6.0具有较高的酶活，表明本专利技术提供的几丁质酶具有较高的稳定性。金属离子和化学试剂影响试验表明，Co
2+
、Na
+
、Mg
2+
、NH
4+
、Ca
2+
、Zn
2+
、K
+
、Tris、尿素对所述几丁质内切酶具有激活作用；Cu
2+
、Fe
3+
、Mn
2+
、Ba
2+
、SDS、EDTA对几丁质内切酶具有抑制作用。
附图说明
[0023]图1为实施例2表达的几丁质酶的SDS
‑
PAGE检测结果；图中，M：彩色预染色蛋白标记，1：离心前破胞总蛋白(终浓度4.5M)，2：几丁质粗酶液，3：破胞总蛋白经Ni
‑
NTABeads 6FF column上样过程中所接取的蛋白，4：破胞总蛋白经100ml浓度为50mM的咪唑洗脱后的杂蛋白，5：4中的杂蛋白经100ml浓度为500mM的咪唑洗脱后的纯化蛋白；
[0024]图2为N
‑
乙酰葡萄糖标准曲线；
[0025]图3为本专利技术实施例4几丁质内切酶酶活的温度曲线；
[0026]图4为本专利技术实施例4几丁质内切酶酶活的温度稳定性曲线；
[0027]图5为本专利技术实施例4几丁质内切酶酶活的pH曲线；
[0028]图6为本专利技术实施例4几丁质内切酶酶活的pH稳定性曲线；
[0029]图7为本专利技术实施例4金属离子与化学试剂对几丁质内切酶酶活的影响。
具体实施方式
[0030]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质酶，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。2.一种编码权利要求1所述几丁质酶的AfChi18基因，其特征在于，所述AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括编码权利要求1所述几丁质酶的AfChi18基因的核苷酸序列。4.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株表达权利要求3所述的重组质粒。5.一种权利要求1所述几丁质酶的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将AfChi18基因与质粒载体连接，得到重组质粒；(2)将所述重组质粒转化至克隆菌株，得到重组克隆菌株；(3)提取所述重组克隆菌株中的质粒，转化至表达菌株，得到重组表达菌株；(4)将重组表达菌株进行诱导培养，收集菌体破碎，得到几丁质酶。6.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述AfChi18基因的扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。7.如权利要求5或6所述的表达方法，其特征在于，所述质粒载体为pET28a，所述克隆菌株为E....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨登峰，伍雅励，潘丽霞，阳丽艳，李红亮，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：