一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的引物组，试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR的引物组，试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及检测领域，尤其涉及一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR的引物组，试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]罗非鱼是很多发展中国家的主要食用蛋白质来源，也是许多渔民和养殖者的重要经济来源。罗非鱼养殖已成为保障全球粮食安全和满足人类营养需求的重要产业。
[0003]2009年以来，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、哥伦比亚等国相继暴发养殖和野生罗非鱼大量死亡事件。直到2014年，才发现其致病病原是新型RNA病毒——罗湖病毒。罗湖病毒是2012年由美国科学家首次发现的危害罗非鱼的一种病毒，它是一种新型的RNA病毒，由10个独特的基因片段组成，直径55
‑
75nm，目前仍未确定其分类地位，极有可能是正粘病毒科的一种新型病毒，与熟知的流感病毒同属一科。罗湖病毒在24
‑
33℃均可以生长，最适温度25℃，所以每年的5
‑
10月份均可能导致发病。感染罗湖病毒的病鱼常见症状为：体色发黑，体表有溃烂，眼睛有明显的病变，发病前期晶状体浑浊，后期晶状体破裂发炎，眼睛内容物浓缩，失去正常视觉功能。2018年Saengchan Senapin等，从无明显临床症状、无死亡的成年罗非鱼和鱼苗中检测出罗湖病毒，提示罗湖病毒可能像ISAV一样存在着变异株。
[0004]至今尚不清楚TiLV(罗湖病毒)的最初来源，野生或养殖的受TiLV感染的鱼群是目前已知的唯一传染源。有证据表明，病鱼的眼睛、大脑和肝脏常常含有高浓度的病毒，其肌肉组织也可能存在病毒。因此，发病死亡的罗非鱼可能是重要的病毒污染源。罗湖病毒是否会通过非罗非鱼物种和其它有机体(如食鱼鸟类和哺乳动物)携带，通过冷冻罗非鱼产品进行传播，目前尚不确定，但粮农组织指出，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁。
[0005]虽然该病原体不会引起公共卫生问题，但可以导致受感染种群大量死亡，感染的鱼因抵抗力变差感染其他病原菌，倘若人生食也有被其他病菌感染的风险。
[0006]目前，还未将TiLV列入检疫名录，也无相应的检测方法。因此，了解TiLV的流行病学和诊断技术，对预防和控制这种外来病具有重要意义。
[0007]国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、RT
‑
PCR，nested RT
‑
PCR,semi
‑
nested RT
‑
PCR,SYBR quantitative RT
‑
PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。因为分子生物学方法具有快速、灵敏、简便的特点，大多数国家都采用其对TiLV进行监测和诊断，在检测和诊断时，也大多采用片段3基因，片段3编码假设蛋白。
[0008]现有检测TiLV的分子生物学方法，大多是针对假设蛋白基因片段，如Japhette Esther Kembou Tsofack等根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立了巢氏RT
‑
PCR方法；Dong等建立的半巢氏RT
‑
PCR方法也是根据片段3建立的；泰国Pitchaporn Waiyamitra等研究人员也是根据片段3保守序列设计引物探针建立了RT
‑
qPCR检测方法；P Tattiyapong等建立的SYBR green RT
‑
qPCR方法，也是根据片段3设计的引物探针，GenBank
序列号为KX631923；国内刘助红等同样是根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立的RT
‑
LAMP方法。“一种罗湖病毒的RT
‑
LAMP检测引物组、试剂盒及方法”“一种罗湖病毒Taq
‑
man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法”根据编码RNA聚合酶的片段1设计引物序列。
[0009]VNNV和TiLV是罗非鱼易感的两种病毒，现有技术并没有同时检测两种病毒的方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种同时检测罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的双重RT
‑
PCR(dRT
‑
PCR)的引物及其试剂盒。可以同时检测两种病毒，缩短时间，加快检测。
[0011]为实现上述目的，本专利技术提供一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR的引物组，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:3和4所示。
[0012]本专利技术还提供一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR的试剂盒，其特征在于，含有所述的引物组。
[0013]进一步，还包括含有SEQ ID NO:5和6所示的DNA作为阳性对照。
[0014]本专利技术还提供一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR方法，其特征在于，含有如下步骤，将待测样本的DNA作为模板，进行双重RT
‑
PCR，根据结果来判断即可。
[0015]进一步，所述双重RT
‑
PCR的反应体系以25μL为例，含有12.5μL的2
×
One
‑
Step Reaction Solution B；1μL的One
‑
Step Enzyme Mix；0.5μL 20μM所述引物组中的每条引物；1μL待检核酸，余量为水。
[0016]进一步，所述RT
‑
PCR的反应条件为，反转录，50℃，30min；预变性，94℃，2min；变性，94℃，30sec；退火，56
±
2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环；最终延伸，72℃，5min。
[0017]进一步，根据结果来判断为根据电泳结果来看，TiLV质粒阳性对照在255bp处出现特异性条带，VNNV质粒阳性对照在120bp处出现特异性条带，阴性对照没有条带，则结果成立，继续判断，
[0018]若样本仅在255bp处出现特异性条带，则样品判定为TiLV dRT
‑
PCR阳性；
[0019]若样品仅在120bp处出现特异性条带，则样品判定为VNNV dRT
‑
PCR阳性；
[0020]若样品在255bp、120bp处均出现特异性条带，则样品判定为TiLV、VNNV dRT
‑
PCR阳性；若样品没有特异性条带，则样品为TiLV、VNNV dRT
‑
PCR阴性。
[0021]检测罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的双重RT...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR的引物组，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:3和4所示。2.一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括含有SEQ ID NO:5和6所示的DNA作为阳性对照。4.一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT
‑
PCR方法，其特征在于，含有如下步骤，将待测样本的DNA作为模板，进行双重RT
‑
PCR，根据结果来判断即可。5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述双重RT
‑
PCR的反应体系以25μL为例，含有12.5μL的2
×
One
‑
Step Reaction Solution B；1μL的One
‑
Step Enzyme Mix；0.5μL 20μM权利要求1的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐淑菲，曾韵颖，孔凡德，刘启霖，林双庆，朱黄鑫，陈信忠，方成俊，
申请(专利权)人：厦门海关技术中心，
类型：发明
国别省市：