一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB17，其保藏号为：CGMCC NO.22587，构建方法为：以菌株SEB14为出发菌株，将菌株SEB14的功能基因ENA5的启动子替换为TEF1的启动子，构建菌株SEB17。本发明专利技术所述菌株SEB17具有多重耐受性，同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。用于多种环境胁迫下物料发酵。用于多种环境胁迫下物料发酵。

【技术实现步骤摘要】
一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]面对能源日益紧缺，环境污染问题日益严重的形势，迫切需要开发绿色、可再生的新型能源。对秸秆、废糖蜜等储量和产生量大的有机废弃物进行资源化利用生产清洁能源燃料乙醇，将可同时缓解能源和环境危机。燃料乙醇工业生产中若能实现超高浓度(VHG)发酵及高温发酵，可显著降低生产成本，减少废水排放量，降低环境污染负荷。因此，选育可耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的多重耐受性工业酿酒酵母菌株，具有重要的经济和环境意义。目前，对于酿酒酵母抗逆性的研究主要集中在单一耐受性的提高，育种的主要方法主要为诱变、驯化、基因组重排和基因工程等，而如何同时提高酿酒酵母的多重耐受性的研究非常有限。然而，多重耐受性酿酒酵母相比单耐受性酵母可以适用于多种实际物料的发酵从而具有更广泛的工业应用价值。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种多重耐受性酿酒酵母菌株，该菌株具有多重耐受性，同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。
[0004]此外，本专利技术还提供一种多重耐受性酿酒酵母菌株的构建方法和应用。
[0005]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0006]一种多重耐受性酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为SEB17，其保藏号为：CGMCC NO.22587，分类命名为Saccharomyces cerevisiae,保藏日期为2021年5月24日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[0007]本专利技术所述菌株SEB17具有多重耐受性，同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。
[0008]一种多重耐受性酿酒酵母菌株的构建方法，以具有良好耐受性的工业菌株SEB14为出发菌株，将功能基因ENA5的启动子替换为在各胁迫下表达量较高且稳定的TEF1的启动子，获得高表达基因ENA5的菌株SEB17。
[0009]研究表明，通过基因工程手段敲除或者高表达一些转录因子或功能基因可以有效提高酿酒酵母的乙酸和糠醛等耐受性，因此，基因工程定向改造酿酒酵母对于其耐受表型的提升十分重要。本专利技术前期基于转录组学的研究发现在高乙醇、高温、高糖和高盐等多种胁迫条件下，工业酿酒酵母菌株SEB14中基因ENA5(编码P型ATP酶)均显著上调，且该基因与各基因之间关系最紧密。目前，仅有研究表明ENA5与真菌的耐盐性密切相关，在本专利技术中，首次发现ENA5与酿酒酵母的多重胁迫耐受性相关。
[0010]具体地：
[0011]出发菌株：
[0012]出发菌株SEB14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19587。
[0013]培养基：
[0014]所用培养基如表1所示。若培养基为固体培养基，则在灭菌前加入2.0％的琼脂粉。灭菌条件为121℃，15min。所有的抗生素均在培养基灭菌后，待冷却至50～60℃后添加。
[0015]表1培养基组成
[0016][0017]质粒、菌株及引物：
[0018]以良好耐受性的工业菌株SEB14(菌株保藏号：CGMCCNo.19587)为出发菌株，通过启动子替换的方法，将基因ENA5过表达获得菌株SEB17，其中所用质粒和菌株如表2所示；菌株转化所用引物及片段如表3所示；用于构建gRNA质粒的所需的同源壁序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列如表4所示。
[0019]表2构建菌株SEB17过程中所用质粒及菌株信息
[0020][0021][0022]表3菌株转化所需引物及片段
[0023][0024]注：TG:gRNA加同源臂引物,RF：修复片段，Vp：验证引物；F：上游引物；R：下游引物
[0025]TEF1 F的序列号为SEQ ID No.1，TEF1 R的序列号为SEQ ID No.2，ENA5 TG F的序列号为SEQ ID No.3，ENA5 TG R的序列号为SEQ ID No.4，ENA5 RF F的序列号为SEQ ID No.5，ENA5 RF R的序列号为SEQ ID No.6，ENA5 V
P F的序列号为SEQ ID No.7，ENA5 V
P R的序列号为SEQ ID No.8，Cas9
‑
dg
‑
F的序列号为SEQ ID No.9，Cas9
‑
dg
‑
R的序列号为SEQ ID No.10，6006
‑
F的序列号为SEQ ID No.11，6005
‑
R序列号为SEQ ID No.12。
[0026]表4构建gRNA所需的同源臂序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列
[0027][0028]注：N20：gRNA所含的PAM位点(NGG)上游的20bp的目标序列；下划线：PAM位点(NGG)
[0029]tgR F的序列号为SEQ ID No.13，tgR R的序列号为SEQ ID No.14，ENA5的序列号为SEQ ID No.15。
[0030]菌株SEB17的构建：
[0031]1)、TEF1启动子(修复片段)的扩增
[0032]以菌株SEB14的基因组DNA为模板，通过PCR扩增TEF1启动子(修复片段)(表5)。PCR反应体系和反应条件如表6所示。RF F/RF R为包含同源臂的TEF1的引物，序列如表3所示。利用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察目标条带。将所得PCR产物保存于
‑
20℃冰箱，备用。
[0033]表5 TEF1启动子基因序列表
[0034][0035]注：P
TEF1
的序列号为SEQ ID No.16。
[0036]表6 PCR扩增TEF1启动子(修复片段)
[0037][0038]2)、构建双链gRNA片段：
[0039]在Saccharomyces Genome Database网站上查询目标基因启动子区域的碱基序列。再将该序列输入到Yeastriction，查找目标片段上PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列。将包含上下游50bp同源臂和20bp目标序列(共120bp)的gRNA片段进行合成(片段序列见表3。待合成之后，用灭菌水稀释至10μM，后将两条互补链溶液按1：1混合(体积比)，于水浴锅中95℃热击5min，获得双链gRNA片段。
[0040]3)、扩增gRNA线性骨架
[0041]以pMEL13质粒为模板，扩增gRNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重耐受性酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB17，其保藏号为：CGMCC NO.22587。2.如权利要求1所述的一种多重耐受性酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，以菌株SEB14为出发菌株，将菌株SEB14的功能基因ENA5的启动子替换为TEF1的启动子，构建菌株SEB17。3.采用权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤岳琴，王莉，谢采芸，苟敏，孙照勇，夏子渊，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：