一种柑橘属中药的在线活性筛选方法技术

本发明专利技术涉及酶抑制剂筛选领域，针对传统的酶抑制剂筛选方法效率低的问题，提供一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，采用电泳介导的微量分析法EMMA，在毛细管中用脂肪酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外400nm处直接测定产物峰面积实现脂肪酶抑制剂的在线筛选，最后利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行验证。本发明专利技术将酶抑制剂的筛选与毛细管电泳相结合，不仅实现了脂肪酶抑制剂的在线筛选，也极大地提高了酶抑制剂筛选的效率，与传统的酶抑制剂筛选方法相比，本方法具有更短的分析时间、更高的分离效率、更少的试剂消耗。更少的试剂消耗。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘属中药的在线活性筛选方法


[0001]本专利技术涉及酶抑制剂筛选领域，尤其是涉及一种柑橘属中药的在线活性筛选方法。

技术介绍

[0002]肥胖已被世界卫生组织(WHO)视为人类最大的流行病，它是导致一系列病理状况的重要危险因素，如高血压、肾脏疾病、糖尿病、高脂血症、冠心病、精神障碍和某些癌症。研究表明，肥胖是由脂肪过度或异常积累引起的。甘油三酯是体内含量最丰富的脂肪类型，主要储存在脂肪组织中。脂肪酶，也称为三酰甘油酰基水解酶，是一类酯酶，在甘油三酯的完全消化中起关键作用，能够将50％至70％的膳食脂肪水解为甘油和脂肪酸。因此，抑制脂肪酶的活性可以有效抑制脂肪的水解和吸收，从而达到减肥的效果。抑制脂肪酶活性是对抗肥胖及其相关疾病的热门话题。奥利司他是唯一被批准用于长期体重管理的脂肪酶抑制剂。然而，它经常表现出强烈的胃肠道副作用，例如胀气、恶心、腹泻和呕吐。因此，寻找安全、有效、新型的脂肪酶抑制剂来治疗肥胖症是非常紧迫和必要的。
[0003]天然产物因含有丰富的生物活性化合物而备受关注。柑橘属果实是世界各国的主要食用果实，也是我国的传统药用植物。它是黄酮类最重要的膳食来源之一。柑橘属黄酮，含有多个酚羟基，例如橙皮苷和柚皮苷等苷类。相关研究表明，柑橘类黄酮具有许多生物活性，例如抗氧化、抗病毒、抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等。研究表明，柑橘属黄酮通过直接或间接介导AMPK、PPAR和NF
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κB信号通路来调节抗氧化的指标进而治疗肥胖，但其对脂肪酶活性的影响鲜有报道。因此，本实验选择从柑橘属黄酮类化合物中进行脂肪酶抑制剂的筛选。
[0004]传统的酶分析方法是将酶和底物离线孵育，然后用分光光度计或酶标仪测定结果。但是该方法自动化程度低、时间长、样品消耗大，不适合酶抑制剂的高通量筛选。近年来，一些新的酶学分析方法，如超滤、中空纤维固定和磁性纳米颗粒固定，已被用于酶抑制剂筛选实验。然而，这些方法也只能用于离线分析。如今，毛细管电泳(CE)作为一种在线酶分析工具已经引起了广泛的关注。研究表明，CE因分析时间短、易于自动化、分离效率高、试剂消耗少等优点，被广泛应用于酶抑制剂的筛选和酶动力学参数的测定。电泳介导的微量分析(EMMA)是CE中广泛使用的一种模式。在EMMA中，毛细管用作微反应器，其中反应物可以连续注入同一毛细管中进行酶促反应、分离和检测。Lilin Tang等人使用EMMA方法筛选中药中的酪氨酸酶抑制剂。Jing Han等人通过EMMA法从12种中药提取物中筛选出一种具有组织蛋白酶B抑制活性的中药。Hairong Wang等人开发了一种用于筛选氨肽酶N抑制剂的EMMA方法(王海荣.2015.氨肽酶N抑制剂毛细管电泳在线筛选方法的研究.Doctoral dissertation,山东大学.)。然而，由于脂肪酶底物难以溶解并且溶解后稳定性差，目前鲜有报道用EMMA方法筛选脂肪酶抑制剂。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了克服传统的酶抑制剂筛选方法效率低的问题，提供一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，将酶抑制剂的筛选与毛细管电泳相结合，不仅实现了脂肪酶抑制剂的在线筛选，也极大地提高了酶抑制剂筛选的效率。与传统的酶抑制剂筛选方法相比，本方法具有更短的分析时间、更高的分离效率、更少的试剂消耗。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，采用电泳介导的微量分析法EMMA，在毛细管中用脂肪酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外400nm处直接测定产物峰面积实现脂肪酶抑制剂的在线筛选，最后利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行验证；所述电泳介导的微量分析法包括以下步骤：(1)预处理：将背景电解质溶液BGE预先注入毛细管；(2)注射：先将脂肪酶溶液注入毛细管，再注入含或不含抑制剂的底物溶液；(3)混合：施加+1.0kV电压使脂肪酶和底物溶液充分混合；(4)孵化：毛细管在没有外部压力和电压的情况下静置；(5)分离：恒定电压下将产物与未反应的底物分离。
[0007]本专利技术开发了一种毛细管电泳介导的在线筛选脂肪酶抑制剂的方法(EMMA方法)，并结合分子对接技术评估柑橘属中药材的抑制活性。通过测量脂肪酶的米氏常数(K
m
)来评估EMMA方法的有效性，并测量了一种市售的脂肪酶抑制剂奥利司他的半数最大抑制浓度(IC
50
)和抑制常数(K
i
)。同时，用该专利技术评价了柑橘属中药材提取物和几种黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用，筛选出了具有脂肪酶抑制潜力的化合物。此外，用超高效液相色谱
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四极杆飞行时间串联质谱(UHPLC
‑
Q
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TOF/MS)对提取物中黄酮类化合物的类型和含量进行分析。最后，利用分子对接研究从理论上验证了黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用。
[0008]作为优选，步骤(1)所述BGE选自：硼砂、磷酸氢二钠、乙酸钠和Tris
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HCl缓冲液中的一种。作为进一步优选，步骤(1)所述BGE为硼砂作为优选，步骤(1)所述BGE的浓度为10
‑
40mM。作为进一步优选，步骤(1)所述BGE的浓度为20mM。
[0009]作为优选，步骤(1)所述BGE的pH为6.4
‑
9.0。作为进一步优选，步骤(1)所述BGE的pH为8.8。
[0010]作为优选，步骤(2)所述底物溶液的制备方法为：将0.1％
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0.2％(w/v)的4
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硝基苯基月桂酸酯溶解在含有1％
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2％Triton X
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100的5
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10mM醋酸钠中，并在沸水中加热帮助溶解，然后将溶液冷却至室温，制得底物溶液。
[0011]作为优选，步骤(2)中毛细管每次进样后，进样端都要浸入去离子水中清洗。以防止相互污染。
[0012]作为优选，步骤(3)所述混合的条件为：施加+1.0kV电压混合5
‑
35s。作为进一步优选，步骤(3)所述混合的时间为25s。
[0013]作为优选，步骤(4)所述静置的时间为1
‑
5min。作为进一步优选，步骤(4)所述静置的时间为3min。
[0014]作为优选，步骤(5)所述恒定电压为20
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25kV。
[0015]因此，本专利技术的有益效果为：(1)建立了一种基于毛细管电泳的脂肪酶抑制剂在线
筛选方法；(2)利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行了验证；(3)本方法快速、高效、成本低，适用于酶抑制剂的高通量筛选。
附图说明
[0016]图1是实施例1
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4不同种类的背景缓冲液在线反应后的电泳图；图2是实施例5
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8不同硼砂浓度下产物的表观迁移率和峰面积图；图3是实施例9
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13硼砂不同pH值下产物的表观迁移率和峰面积图；图4是实施例14
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，其特征在于，采用电泳介导的微量分析法EMMA，在毛细管中用脂肪酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外400nm处直接测定产物峰面积实现脂肪酶抑制剂的在线筛选，最后利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行验证；所述电泳介导的微量分析法包括以下步骤：(1)预处理：将背景电解质溶液BGE预先注入毛细管；(2)注射：先将脂肪酶溶液注入毛细管，再注入含或不含抑制剂的底物溶液；(3)混合：施加+1.0kV电压使脂肪酶和底物溶液充分混合；(4)孵化：毛细管在没有外部压力和电压的情况下静置；(5)分离：恒定电压下将产物与未反应的底物分离。2.根据权利要求1所述的一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述BGE选自：硼砂、磷酸氢二钠、乙酸钠和Tris
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HCl缓冲液中的一种。3.根据权利要求1所述的一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述BGE的浓度为10
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40mM。4.根据权利要求1或2或3所述的一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述BGE的pH为6.4
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹君，闫天赐，乐紫璇，顾郁欣，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：