本发明专利技术公开了一种基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，其特征在于，包括以下步骤：标记位点筛选：基于NGS测序PANEL基因列表，初步筛选出MAF>0.3的SNP位点；通过SNaPshot多重引物设计和实验检测稳定性筛选出20个位点；分别设计出20个位点的引物并合成；利用上述合成的引物与样本DNA提取液依次发生PCR反应、第一次SAP纯化反应、单碱基延伸反应、第二次SAP纯化反应、测序以及收集数据；本发明专利技术通过SNaPshot多重引物设计筛选出20个位点和根据这20个位点设计合适的引物，实现了单个反应能够检测20个位点，提升检测效率和降低检测成本。降低检测成本。
【技术实现步骤摘要】
基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法。
技术介绍
[0002]随着精准医学项目在全世界范围内的不断开展，基于新一代测序(NGS)技术的大规模基因组数据采集已经成为重要的研究手段之一。在此基础上建立起来的大数据平台，辅以精准、全面的健康和医学数据，将为疾病的诊断与治疗，药物的研发与个体用药，人群的健康保障等临床与转化医学研究带来极大的推动。
[0003]在大规模人群中开展NGS测序工作时，样本的准确性、可溯源性将会对最终的大数据质量产生不可忽视的影响。由于NGS测序流程的复杂性，在样本库内得到准确标记的样本，在测序流程中仍然有一定几率会发生混淆或者污染。根据国际上大型测序中心的估算，随着测序样本量的增加，一个操作流程完善、工作人员受过专业培训的基因检测实验室，仍然有可能产生千分之一左右的样本偏差，因此，一种准确有效却又成本低廉的样本标记与追踪手段，在大规模NGS测序工作中具有重要的现实意义。
[0004]在美国ACMG(美国医学遗传学与基因组学学院)发布的“临床实验室NGS测序标准”中指明：“相关实验室必须采取措施，避免样本混淆，并能够随时追踪与确认终结果”。2017年3月，中华医学会病理学分会发布的“临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识”中进一步阐明：“为确保检测过程中样本没有混淆或污染，可选用多个SNP位点或其他标签作为样本身份标识(sample ID)，在检测前对每个样本进行SNP位点信息的测定，在NGS检测后对上述位点进行追踪，证明没有交叉污染”。
技术实现思路
[0005]针对现有NGS测序流程的复杂性，在样本库内得到准确标记的样本，在测序流程中仍然有一定几率会发生混淆或者污染的问题，本专利技术提供一种基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法。
[0006]为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：一种基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，包括以下步骤：
[0007]标记位点筛选：基于NGS测序PANEL基因列表，初步筛选出MAF>0.3的SNP位点；通过SNaPshot多重引物设计筛选出20个位点；
[0008]分别设计出20个位点的引物并合成；
[0009]利用上述合成的引物与样本DNA提取液依次发生PCR反应、第一次SAP纯化反应、单碱基延伸反应、第二次SAP纯化反应、测序以及收集数据。
[0010]进一步限定，所述20个位点的上游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1
‑
20所示，所述20个位点的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.21
‑
40所示。
[0011]进一步限定，所述20个位点的单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.41
‑
60
所示。
[0012]进一步限定，所述PCR反应包括以下步骤：
[0013]配制PCR混合液且离心；混合PCR混合液和样本DNA提取液的DNA得到混合物；将混合物按照如下程序进行反应：预变性、94℃、5min；变性94℃、20sec，退火60℃、30sec，延伸72℃、30sec，变性、退火以及延伸组成的过程循环35次；最后延伸72℃，3min；保存温度4℃。
[0014]进一步限定，所述第一次SAP纯化反应包括以下步骤：配制SAP处理反应液；将PCR产物与SAP处理反应液混合，得到待测液；将待测液按照如下程序进行反应：37℃、40min；85℃、15min；4℃保存；优选地，所述第二次SAP纯化反应包括以下步骤：将单碱基延伸反应得到的产物与SAP处理反应液混合且置于95℃变性5min，然后置于
‑
20℃下骤冷。
[0015]进一步限定，所述单碱基延伸反应包括以下步骤：配制反应体系，反应体系按照如下程序进行反应：95℃、30sec；95℃、5sec，52℃、5sec，60℃、5sec，循环30次；保存温度4℃。
[0016]进一步限定，所述测序具体如下：向第二次SAP纯化反应纯化得到的产物中加入含有质量分数为2％LIZ120的去离子甲酰胺，95℃变性5min，置于
‑
20℃下骤冷，然后测序。
[0017]进一步限定，所述样本DNA提取液包括从血样、组织、细胞和唾液中提取得到的4个样本。
[0018]进一步限定，所述20个位点如下：rs10172036、rs1053266、rs11167136、rs1139971、rs11737、rs13214239、rs1455556、rs1656922、rs17655、rs1801552、rs2229571、rs2229992、rs2293277、rs2296241、rs238406、rs2516835、rs2686817、rs3115438、rs3819122、rs4981088；
[0019]1)从已公布发表的文献中检索常用NGS测序PANEL基因列表，筛选出测序频率较高的20个基因：ICOS、CCDC6、TSNARE1、CD82、TSPAN3、FANCE、SERPINB5、KNG1、ERCC5、CDH1、BARD1、APC、CEP55、CYP24A1、ERCC2、LIPT1、PKD1L1、DNAH3、SMAD4、OR11G2作为SNP标记候选区域；
[0020]2)根据SNP位点的最小等位基因频率，筛选出MAF>0.3的位点进行SNaPshot分型多重体系设计和预实验筛选，最终得到适合多重检测且可稳定检出的20个SNP位点。
[0021]进一步限定，所述20个位点的引物设计是基于位点上游500bp的核苷酸序列和下游500bp的核苷酸序列设计的。
[0022]有益效果：本专利技术通过SNaPshot多重引物设计筛选出20个位点和根据这20个位点设计合适的引物，实现了单个反应能够检测20个位点，提升检测效率和降低检测成本。
具体实施方式
[0023]实施例1
[0024]基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法体的具体实施步骤如下：
[0025]S1：20个位点的筛选
[0026]基于NGS测序常见PANEL基因列表，初步筛选出MAF>0.3的SNP位点，进一步通过SNaPshot多重引物设计筛选出20个位点，用于NGS测序样本标记与追踪实验；
[0027]具体如下：1)从已公布发表的文献中检索常用NGS测序PANEL基因列表，筛选出测序频率较高的20个基因：ICOS、CCDC6、TSNARE1、CD82、TSPAN3、FANCE、SERPINB5、KNG1、
ERCC5、CDH1、BARD1、APC、CEP55、CYP24A1、ERCC2、LIPT1、PKD1L1、DNAH本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，其特征在于，包括以下步骤：标记位点筛选：基于NGS测序PANEL基因列表，初步筛选出MAF>0.3的SNP位点；通过SNaPshot多重引物设计筛选出20个位点；分别设计出20个位点的引物并合成；利用上述合成的引物与样本DNA提取液依次发生PCR反应、第一次SAP纯化反应、单碱基延伸反应、第二次SAP纯化反应、测序以及收集数据。2.根据权利要求1所述的基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，其特征在于，所述20个位点的上游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1
‑
20所示，所述20个位点的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.21
‑
40所示。3.根据权利要求1或2所述的基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，其特征在于，所述20个位点的单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.41
‑
60所示。4.根据权利要求1所述的基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，其特征在于，所述PCR反应包括以下步骤：配制PCR混合液且离心；混合PCR混合液和样本DNA提取液的DNA得到混合物；将混合物按照如下程序进行反应：预变性、94℃、5min；变性94℃、20sec，退火60℃、30sec，延伸72℃、30sec，变性、退火以及延伸组成的过程循环35次；最后延伸72℃，3min；保存温度4℃。5.根据权利要求1所述的基于SNaPshot分型方法的NGS测序样本标记与追踪检测方法，其特征在于，所述第一次SAP纯化反应包括以下步骤：配制SAP处理反应液；将PCR产物与SAP处理反应液混合，得到待测液；将待测液按照如下程序进行反应：37℃、40min；85℃、15min；4℃保存；优选地，所述第二次SAP纯化反应包括以下步骤：将单碱基延伸反应得到的产物与SAP处理反应液混合且置于95℃变性5min，然后置于
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20℃下...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙远志，
申请(专利权)人：武汉天一华煜基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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