一种检测细胞色素P4502C9的近红外型荧光探针及其应用制造技术

一种检测细胞色素P450 2C9的近红外型荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。该特异性探针底物可用于测定生物体系中CYP2C9的酶活性。CYP2C9酶活性测定的流程如下：选择1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮O-脱烷基反应为探针反应，通过定量检测单位时间内底物1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的消除量或其脱烷基代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP2C9酶的活性。本发明专利技术可用于不同来源、不同种属、不同个体的生物样本中CYP2C9酶活的定量评估以及生物体中CYP2C9的成像，以期实现CYP2C9处置药物能力的评估。还可用于CYP2C9活性调节剂的体外快速筛选，评估药物及候选化合物等由于抑制或激活CYP2C9催化活性而导致药物药物相互作用的潜在性。在性。在性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞色素P450 2C9的近红外型荧光探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测细胞色素P450 2C9(CYP2C9)的近红外荧光探针及其应用。

技术介绍

[0002]细胞色素P450酶是一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族，广泛分布于自然界。在人体内，可介导如脂肪酸、甾体类激素及胆固醇等内源物的生物转化，在药物、致癌物、环境污染物等外源物质的代谢清除或生物激活中亦发挥着重要作用。
[0003]CYP2C9是细胞色素P450超家族中的一员，主要分布于肝脏、肠道等人体重要代谢器官中。据统计，CYP2C9参与超过20％的临床常用药物(大于100种)的代谢，如苯妥英、华法林、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、双氯芬酸和洛沙坦等均是CYP2C9的底物(Curr Med Chem.2011,18:667-713)。由于CYP2C9底物非常广泛，临床上常常会出现共服药物通过调节CYP2C9活性而诱发药物药物相互作用的情况。值得注意的是，CYP2C9可介导苯妥英、华法林、甲苯磺丁脲等窄治疗窗药物的代谢清除(Drug Metab Dispos.1996,24:1401-1403；Blood.2018,132:2230-2239；Drug Metab Dispos.2000,28:354-359)。由此，共服药物对CYP2C9代谢的抑制作用就极有可能导致药物暴露水平增高而诱发严重的药物毒副作用。因此，CYP2C9的催化能力与药物的安全使用息息相关。而CYP2C9在生物样本和生物体中的实时活性检测有助于准确表征CYP2C9的酶活性变化水平，对CYP2C9介导的药物代谢情况及药物药物相互作用潜在性进行定量定性评估。
[0004]荧光分子成像技术具有生物体系干扰度低、可实时成像、与高通量检测设备相匹配等特点，在生物样本的体外检测和生物靶点的在体检测方面的应用日益突出。因此，开发高选择性的CYP2C9的近红外荧光探针及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测细胞色素P450 2C9(CYP2C9)的近红外型荧光探针及其应用，该近红外型荧光探针底物没有荧光，脱烷基产物激发后可在近红外区域发射荧光。利用该探针反应可对多种生物体系或生物体中CYP2C9的表达和功能水平进行定量评价。
[0006]本专利技术提供了一种检测CYP2C9的近红外型荧光探针，该探针可被CYP2C9特异性催化生成相应的脱烷基产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮，其结构通式如式(1)所示，1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类结构，其结构通式如下：
[0007][0008]其中，R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环丁基、异丁基、正戊基、环戊基、苯基、苄基。
[0009]本专利技术中1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物具有代谢酶高选择性(主要由CYP2C9代谢激活)，代谢产物易于检测、且灵敏度高等特点。
[0010]本专利技术还提供了所述检测CYP2C9的近红外型荧光探针，采用上述式(1)化合物作为CYP2C9酶的特异性底物，进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其脱烷基产物的生成率或荧光成像信号的变化，来定量测定不同生物体系(包括重组表达酶、人或动物组织制备品、各类细胞及制备品等生物样品)中CYP2C9活性；具体测定方法为：
[0011]——体系中以1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物作为近红外型探针底物；底物浓度选择1/10～10K
m
；单点测定时底物浓度优选K
m
。
[0012]——在含有NADPH的缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH 7.4为反应pH值；
[0013]——反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的脱烷基产物达到定量限，且底物转化率不超过20％时终止反应；
[0014]——测定单位时间内的脱烷基产物生成量(底物减少量)或荧光成像信号的变化作为CYP2C9活性的评价指标。
[0015]本专利技术提供的CYP2C9近红外型荧光探针及其应用，该探针底物没有荧光，其脱烷基产物具有近红外荧光属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；脱烷基产物荧光检测条件分别为：激发波长600nm，发射波长为630-690nm。
[0016]该特异性探针底物为近红外型荧光探针，其在CYP2C9活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组CYP2C9酶、人及动物细胞、组织制备品中CYP2C9酶活力的定量测定；同时也可作为在体及动物整体CYP2C9的探针底物，评估代谢酶CYP2C9的个体及种属差异。该探针底物及脱烷基代谢产物的荧光检测方法，还可用于CYP2C9活性调节剂(抑制剂或激活剂)的快速筛选及调节能力的定量评价。
[0017]通过相关性分析，重组单酶代谢反应，特异性抑制等实验，证明1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物可特异性的经CYP2C9转化而生成脱烷基产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮。
[0018]作为CYP2C9高特异性的近红外荧光探针底物，该化合物可以用来检测各种克隆表达体系中，多种哺乳动物来源的组织切片、细胞、微粒体、S9等制备物中CYP2C9的活性标定。
[0019]选用本专利技术所述CYP2C9的近红外型荧光探针反应检测CYP2C9酶活性具有以下突出优势：
[0020](1)高特异性：1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物可被CYP2C9高特异性地代谢成一个代谢产物，即脱烷基产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2
(9H)-吖啶酮。
[0021](2)廉价易得：1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
[0022](3)高灵敏度：具有1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物脱烷基产物具有良好的荧光光谱特性，激发后可在近红外区域发射荧光，能很好的减少生物体系中的背景荧光干扰。
附图说明
[0023]图1. 1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物的结构通式。
[0024]图2. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的1H-NMR谱图。
[0025]图3. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的
13
C-NMR谱图。
[0026]图4. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的高分辨质谱图。
[0027]图5. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞色素P450 2C9的近红外型荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物可被CYP2C9特异性催化生成相应的脱烷基产物，该底物具有1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类结构，其结构通式如下：其中，R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环丁基、异丁基、正戊基、环戊基、苯基、苄基；该类探针应用为以该类探针作为底物与生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其脱烷基产物的生成率或荧光成像信号的变化来定量测定细胞色素P450 2C9的活性。2.根据权利要求1所述的一种检测细胞色素P450 2C9的近红外型荧光探针的应用，其特征在于：所述定量检测的具体测定方法及条件如下：A.体系中以1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮作为探针底物；底物浓度选择1/10～10K
m
；B.在含有NADPH的缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；C.反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的脱烷基产物达到定量限，且底物转化率不超过20％时终止反...

【专利技术属性】
技术研发人员：马骁驰，冯磊，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：