一种适用于表达抗体的VEEV表达载体及应用制造技术

本发明专利技术属于动物疫苗技术领域，具体涉及一种适用于表达抗体的VEEV表达载体及应用。本发明专利技术以该mRNA以缺失结构蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC

【技术实现步骤摘要】
一种适用于表达抗体的VEEV表达载体及应用


[0001]本专利技术属于动物疫苗
，具体涉及一种适用于表达抗体的VEEV表达载体及应用。

技术介绍

[0002]近年来，mRNA技术已经成为免疫治疗的一个强有力的工具，使用mRNA编码抗体的可行性已被证实用于治疗病毒、毒素和肿瘤。一般情况下，单克隆抗体重链和轻链的编码序列由两个独立的mRNA表达，这些mRNA与可离子化的脂质和类脂质材料组成脂质纳米粒(LNPs)，用于体内传递。由于两条链的长度和表达率不同，为了提高整个IgG的折叠和组装，需要优化轻重链的比例。目前，大多数编码抗体的mRNA主要通过包裹LNPs进入细胞。尽管LNP系统是一种很有前途的mRNA细胞内传递载体，但由于缺乏LNP安全性评价的临床数据，其临床转化受到安全性问题的限制。
[0003]甲病毒复制子颗粒(VRPs)是一种很有前途的高效病毒载体，可用于传递广泛的易感宿主细胞和高水平的细胞质蛋白表达。甲病毒属病毒是单股正链RNA病毒，包括委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)和塞姆利基森林病毒(SFV)。其中VEEV病毒由于其复制速率快，病毒滴度高，宿主范围广等优势，其复制子颗粒(VRPs)系统因而被广泛应用。VRP包含一个自我复制的复制子RNA，编码病毒复制酶蛋白(nsP1
‑
nsP4)和由sg 启动子启动表达的外源蛋白基因。以及2个不具有复制功能但由sg启动子分别启动表达的 VEEV病毒的Capsid蛋白基因和E蛋白基因的helper RNA；其缺失了nsP4蛋白的部分基因序列因而丧失自我复制功能。但当复制子RNA以及helper RNAs同时存在时，复制子编码的病毒复制酶蛋白(nsP1
‑
nsP4)既可起始自身RNA的复制表达又可起始SG启动子的表达；因而导致复制子RNA的复制表达以及外源基因的表达和helper RNA上的capsid蛋白和E 蛋白基因的表达。capsid蛋白和E蛋白包裹复制子RNA形成类似VEEV病毒结构的具有单次感染性的VEEV VRP颗粒。甲病毒VRP系统由于具有较高的外源基因转移和表达能力，已广泛应用于基因转导、肿瘤治疗和疫苗研制等领域。一些基于VRP的疫苗针对感染性疾病或癌症的临床试验已经进行，仅发生了与安慰剂组反应模式相似的轻微或中度不良事件，证实了基于VRP的疫苗的安全性和耐受性。
[0004]抗体由轻链及重链组成，当表达一个完整抗体时，人们通常采用使用2个mRNA分别表达其重链及轻链，而由于两条链的长度和表达率不同，为了提高整个抗体的折叠和组装，通常需要优化表达轻重链mRNA的比例。为了规避这一点，近年来人们也在开发使用1个mRNA同时表达抗体轻链及重链的方法，例如在重链及轻链之间加入T2A的序列，希望由 T2A介导的核糖体跳跃使重链轻链的分别表达，再由宿主体内的弗林蛋白酶切割T2A。或插入IRES序列，通过其实现重链轻链的分别表达。
[0005]目前针对于mRNA表达抗体，通常会选择肌肉或静脉的方式进行动物体内的递送。而目前许多流行的传染病的病原体均是通过呼吸道传播的，例如新型冠状病毒，流感病毒，呼吸道合胞病毒等。对于这些病毒而言，肺是其感染的重要预防目标。将治疗药物有针对性
地输送到感兴趣的器官，可最大限度地减少抗体免疫反应和全身毒性，并减少使用的抗体治疗量；因此鼻腔给药也是目前此类病毒的治疗及预防给药的主要研究方向。此外，鼻腔给药也比传统的给药方式更容易，无需针头，这将增加成人和儿童的接受度。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供了一种适用于表达抗体的VEEV表达载体，所述载体的为SEQID NO.1所示。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供了一种适用于表达抗体的VEEV表达载体在表达IgG中的应用。本专利技术的载体可同时表达单抗重链和轻链的mRNA，该mRNA可与helper RNAs 一起包装得到VRP。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0009]一种适用于表达抗体的VEEV表达载体，该表达载体是通过以缺失结构蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC
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83复制子为载体，额外插入第二个SG启动子获得，所述的载体为SEQ ID NO.1所示。
[0010]一种适用于表达单抗的VEEV表达载体的应用，包括利用本专利技术的表达载体，用于制备单抗，或是制备含有单抗的VRP或是制备含有单抗的VEEV复制子的mRNA，本专利技术载体制备的mRNA或VRP可以制备成相应毒株的疫苗。
[0011]以上所述的应用中，其中一个应用过程包括：将病毒单抗的重量和轻链基因分别插入到该载体的SG启动子后，获得含有该病毒单抗的VEEV复制子，该复制子与helper RNAs 一起包装得到VRP，可用于直接表达单抗，或是直接作为病毒疫苗，或是直接将含有该单抗的VEEV复制子的mRNA制备为病毒疫苗。
[0012]以上所述的应用中，优选的，是将新型冠状病毒中和抗体CB6的序列，GenBank：M T470196.1and MT470197.1，分别插入到该载体的SG启动子后，获得含有该单抗的VEEV 复制子，VEEV
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CB6复制子(SEQ ID NO.2所示)与helper RNAs共转后，获得VEEV
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CB6
ꢀ‑
VRP。
[0013]本专利技术获得的VEEV
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CB6
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VRP可用于制备滴鼻剂型的新冠疫苗，VEEV
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CB6复制子的mRNA也可作为滴鼻剂型的新冠疫苗。
[0014]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0015]1.本专利技术构建的复制子以VEEV
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CB6 RNA为例所采用的反向遗传学技术，具有先进成熟、方便简捷、定位可控等优点。
[0016]2.本专利技术构建的复制子以VEEV
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CB6 RNA为例是可自我复制的，并且通过1个mRNA同时表达抗体的重链及轻链，保证了mRNA进入细胞后整个IgG的高效表达和恰当组装。
[0017]3.本专利技术生产的VRP，以VEEV
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CB6 VRP为例可通过RNA共转方式获得，操作较为简单。
[0018]4.本专利技术提供的VRP，以VEEV
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CB6 VRP为例，通过滴鼻感染的方式可在小鼠肺部有效表达，使VRP递送mRNA表达的抗体靶向至小鼠肺部，该抗体可在肺部持续表达一段时间，并且可对随后的新型冠状病毒的感染提供保护。
[0019]综上所述，基于委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC
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83复制子载体，构建的VEEV
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CB6复制子RNA可有效表达CB6抗体，通过与helper RNAs共转可获得的VRP，在感染后也有效表达CB6抗体，并具备相应的新型冠状病毒中和作用，且在小鼠体内可提供有效的保护作用，具
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于表达单抗的VEEV表达载体，所述的载体为SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的表达载体在制备单抗中的应用。3.权利要求1所述的表达载体制备的含有单抗的VEEV复制子。4.权利要求3所述的含有单抗的VEEV复制子制备的含有单抗的VRP。5.权利要求3所述的含有单抗的VEEV复制子的mRNA。6.权利要求4所述的含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，李晓丹，李嘉琪，张哲瑞，张宏庆，张亚南，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：