基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用。该基因表达盒包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron

【技术实现步骤摘要】
基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗
β
地中海贫血症的应用


[0001]本专利技术涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用。

技术介绍

[0002]β地中海贫血症是由于编码β珠蛋白的基因出现突变而导致的隐性遗传性血液疾病。不同基因型β
‑
地中海贫血患者的症状严重程度不同，无法产生任何β珠蛋白的基因称为β0基因，携带两个β0基因拷贝的患者症状最为严重。为了存活，输血依赖性β型地中海贫血症(TDT)患者需要终生频繁输血和铁螯合疗法排铁，TDT患者面临着因铁过量引起的进行性多器官衰竭等并发症的风险。目前，能够治愈TDT的治愈性疗法是进行异体造血干细胞移植(HSCT)，但HSCT很难找到合适的HLA配型，而且存在包括由治疗而导致的死亡、移植物衰竭、移植物抗宿主疾病和机会性感染等并发症的风险，特别是由非直系血亲提供的HSCT。因此，现有的疗法或者无法一次性治愈TDT患者，极大地影响了患者的生活质量，增加患者和国家的医疗负担；或者很难找到合适的HLA配型，只有很少的患者能够从中受益；即使找到了合适的HLA配型，也冒着多种并发症的风险。
[0003]理论上从基因层面增加细胞正常β
‑
珠蛋白的表达，患者将获得终身的治疗。此外，提高患者体内γ
‑
珠蛋白的表达，也可取得功能上代偿β珠蛋白生成不足的效果。目前获批的或者研究中的基因疗法通常采用在造血干细胞(HSC)中过表达正常β
‑
珠蛋白/γ
>‑
珠蛋白的方法或者表达促进γ
‑
珠蛋白表达的基因的方法，使患者的HSC可适宜的表达β
‑
珠蛋白/γ
‑
珠蛋白，从而部分治愈β
‑
地中海贫血症患者或缓解β
‑
地中海贫血症的症状，很大程度上提高了患者的生活质量。但仍无法一次性治愈重型β
‑
地中海贫血症患者。
[0004]在生物体内，β
‑
珠蛋白的表达具有红系特异性，研究表明β
‑
LCR(Locus Control Region)控制着包括β
‑
珠蛋白在内的一系列珠蛋白的时间和空间特异性表达。胎儿在出生6个月后，胎儿型HbF(α2γ2)的量小于总血红蛋白的5％，到两岁时小于1％。β
‑
珠蛋白基因及调控γ
‑
珠蛋白表达的基因BCL11A在HSC中组成性表达会损害HSC的功能及分化。因此，外源基因需要置于LCR的调控之下，抑制BCL11A基因的表达将有利于γ
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珠蛋白的表达。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种基因表达盒，其包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron
‑
BCL11A
‑
shRNAmir以及多腺苷酸化信号；
[0007]所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0008]所示intron
‑
BCL11A
‑
shRNAmir的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0009]所述启动子为红系细胞特异性的II型启动子。
[0010]可选的，如上所述的基因表达盒，所示启动子的上游还具有增强子。
[0011]可选的，如上所述的基因表达盒，所述增强子为来自β珠蛋白的LCR的HS3与HS2增
强子，其中HS3位于HS2的上游。
[0012]在一些实施方式中，HS3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0013]在一些实施方式中，HS2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
[0014]可选的，如上所述的基因表达盒，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0015]可选的，如上所述的基因表达盒，所述多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0016]本专利技术的第二目的在于提供一种包含如上所述的基因表达盒的载体。
[0017]本专利技术的第三目的在于提供一种慢病毒包装载体，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的5
’
LTR和位于下游的3
’
LTR，所述基因表达盒反向插入所述5
’
LTR和所述3
’
LTR之间。
[0018]可选的，如上所述的慢病毒包装载体，所述慢病毒包装载体具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
[0019]本专利技术的第四目的在于提供一种慢病毒包装载体系统，其能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒，其特征在于，包含如上所述的慢病毒包装载体。
[0020]可选的，如上所述的慢病毒包装载体系统，所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统。
[0021]本专利技术的第五目的在于提供如上所述的慢病毒包装载体系统包装得到的慢病毒颗粒。
[0022]本专利技术的第六目的在于提供药物组合物，其包括如上所述的慢病毒包装载体系统和/或如上所述的慢病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。
[0023]本专利技术的第七目的在于提供一种如上所述的慢病毒包装载体系统和/或如上所述的慢病毒颗粒在制备用于治疗β地中海贫血症的药物中的应用。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术构建的基因表达盒，可在红系细胞中特异性的上调β珠蛋白和γ
‑
珠蛋白的表达，两种机理协同作用，治疗效果显著增强。在表达外源性β珠蛋白的同时，使用嵌合于内含子的基于miRNA骨架的shRNA表达技术表达BCL11A的shRNA，使shRNA像内源性miRNA一样受控于II型启动子，跟HBB基因一起实现红细胞特异性的表达，可用于治疗β0/β0重型地贫患者，具有潜在的巨大经济效益和社会效益。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为本专利技术一个实施例中红系特异性表达的“all
‑
in
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one”载体结构示意图；
[0028]图2为本专利技术一个实施例中所使用的β珠蛋白的结构示意图；
[0029]图3为本专利技术一个实施例中本专利技术所使用的慢病毒表达载体结构示意图；A.pCDH
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miR E5
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HS2
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HS3；B.pCDH
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βglobin
‑
HS2
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HS3；C.pCDH
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基因表达盒，其特征在于，包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron
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BCL11A
‑
shRNAmir以及多腺苷酸化信号；所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所示intron
‑
BCL11A
‑
shRNAmir的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述启动子为红系细胞特异性的II型启动子。2.根据权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所示启动子的上游还具有增强子。3.根据权利要求2所示的基因表达盒，其特征在于，所述增强子为来自β珠蛋白的LCR的HS3与HS2增强子，其中HS3位于HS2的上游。4.根据权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。5.根据权利要求1～4任一项所示的基因表达盒，其特征在于，所述多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。6.包含权利要求1～5任一项所述的基因表达盒的载体。7.慢病毒包装载体，沿病毒基...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏，李光超，周兆，
申请(专利权)人：广州百暨基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：