一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株溶藻弧菌pstS基因沉默菌株，所述菌株为Vibrio alginolyticus pstS

【技术实现步骤摘要】
一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用。

技术介绍

[0002]溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，是一种广泛存在于海洋和河口，可以从病人体内、海水、水产品等多种不同环境中分离得到的革兰氏阴性杆菌。溶藻弧菌除了可引起鱼、虾、贝类等水产品患病与大量死亡，造成严重的经济损失外，还可感染人体引起皮肤感染、外耳道感染等多种疾病。目前，用于防治溶藻弧菌的药物主要是抗生素，抗生素的不当使用容易产生细菌耐药性、导致药物残留等危害。因此，亟需开发防治溶藻弧菌病的生物药物或者疫苗。
[0003]磷的吸收和利用在生物体遗传、能量代谢、细胞膜的完整性和细胞内信号传递等生物过程中发挥着重要的作用。在细菌中，主要由磷酸盐特殊转运系统(phosphate specific transport，Pst)和磷酸盐转运系统(Pi transport，Pit)来完成对无机磷酸盐(inorganic phosphates，Pi)的吸收和利用，其中Pst系统是Pi吸收转运的关键系统。该系统是细菌在低Pi环境下，以高亲和力结合Pi，并将其转运至细胞质内的磷酸盐转运系统。该系统包含3个结构域，分别是底物结合结构域、跨膜结构域和ATP结合结构域。在E.coli等大部分细菌中，Pst系统一般由PstS、PstC、PstA、PstB和PhoU 5个蛋白组成。其中，PstS为外周结合蛋白，是Pst系统中的关键蛋白，该蛋白与Pi具有极高的亲和性，负责感知和结合周质空间的Pi，由pstS基因编码。
[0004]目前有报道在大肠杆菌(E.coli)以及蓝藻细菌(Cyanobacteria)等细菌中采用突变等手段获得pstS基因变异株，但尚未见pstS基因缺失或突变的重组溶藻弧菌pstS基因株报道，更未见利用RNAi技术稳定沉默筛选获得溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用，解决了上述
技术介绍
中的问题。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株，其为Vibrio alginolyticus pstS
‑
RNAi，于2021年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2021764。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株在制备预防和/或治疗哈维氏弧菌病疫苗中的应用。
[0008]本专利技术提供的溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株是通过如下技术手段进行构建：
[0009]S1.通过比较转录组学分析技术，将筛选致病功能基因目标锁定pstS基因，qRT
‑
PCR验证pstS基因；
[0010]S2.根据目的基因序列设计shRNA并连接到质粒pACYC184上，组成重组质粒pACYC184
‑
shRNA，重组质粒pACYC184
‑
shRNA热激转化导入DN5α感受态中，通过测序验证shRNA是否连接成功。
[0011]S3.shRNA连接成功后，重组质粒pACYC184
‑
shRNA导入大肠杆菌SM10感受态中。
[0012]S4.将含有重组质粒pACYC184
‑
shRNA的大肠杆菌SM10以接合的方式导入到野生型溶藻弧菌中并通过16S测序验证。
[0013]S5.使用qRT
‑
PCR检测pstS稳定沉默株中该基因的相对表达量。其中，每个基因设计两个位点的shRNA，选择沉默效率最佳的稳定沉默菌株命名为“pstS
‑
RNAi”，即本专利技术的Vibrio alginolyticuspstS
‑
RNAi。
[0014]S6.通过粘附性实验、生物膜形成实验、运动性实验、毛细血管趋化实验验证本pstS基因稳定稳定沉默株与野生型溶藻弧菌毒力的差异。本专利技术还通过对pstS基因稳定沉默株的转录组测序，揭示pstS基因可能通过调控细菌分泌中相关基因来影响溶藻弧菌的毒力。
[0015]本专利技术具有如下有益效果：
[0016]1.本专利技术溶藻弧菌pstS基因稳定沉默株的粘附能力、生物膜形成能力、运动性以及趋化性显著低于野生型溶藻弧菌，可用于研制预防或治疗溶藻弧菌病疫苗。
[0017]2.转录组测序分析结果表明，pstS基因的稳定沉默改变了溶藻弧菌的转录组表达，pstS基因可能通过调控细菌分泌中相关基因，进而影响溶藻弧菌的毒力。这说明溶藻弧菌pstS基因稳定沉默株可用于研究溶藻弧菌的致病机理，可为水产动物溶藻弧菌病的预防和治疗寻找新的靶点。
附图说明
[0018]图1为转录组数据与qRT
‑
PCR结果对比图。
[0019]图2为溶藻弧菌pstS基因稳定沉默效率图。
[0020]数据表示为平均值
±
SD；每组进行三次独立的生物学重复，**代表P<0.01。
[0021]图3为野生型溶藻弧菌与pstS基因稳定沉默菌株的生长曲线图。
[0022]图4为野生型溶藻弧菌及pstS基因稳定沉默菌株的粘附能力结果图。
[0023]图5为野生型溶藻弧菌及pstS基因稳定沉默菌株的生物膜形成能力结果图。
[0024]图6为野生型溶藻弧菌及pstS基因稳定沉默菌株的运动性结果图。
[0025]A：菌落直径大小B：细菌在半固体琼脂平板上的生长情况
[0026]图7为野生型溶藻弧菌及pstS基因稳定沉默菌株的趋化性结果图。
[0027]图8为溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株的转录组碱基组成分布图。
[0028]其中，图(a)，(b)，(c)为野生型溶藻弧菌的转录组碱基组成分布图；图(d)，(e)，(f)为溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株的转录组碱基组成分布图。
[0029]横坐标是reads碱基坐标，坐标表示reads上从5
’
到3
’
端依次碱基的排列；
[0030]纵坐标是所有reads在该测序位置碱基占的百分比，不同碱基用不同颜色表示。
[0031]图9为溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株的转录组碱基质量分布图。
[0032]横坐标是reads碱基坐位置，表示reads上从5
’
到3
’
端依次碱基的排列；
[0033]纵坐标是所有reads在该位点处碱基的Q值。
[0034]前半部分为双端测序序列的第一端测序Reads的Q值分布情况，后半部分为另一端测序reads的Q值分布情况。
[0035]图10为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株，其特征在于：为Vibrio alginolyticus pstS
‑
RNAi，于2021年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓津，祁欣，江兴龙，易鑫，陈郁浓，郑江，黄力行，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：