一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法技术

本发明专利技术提供了一种洋葱伯克霍尔德菌复合体(BCC)的特异性检测靶点和恒温快速检测方法。该特异性检测靶点为secY基因，根据该基因设计了RPA引物组合物，其包括序列选自SEQ ID No.1～6中一条的上游引物和序列选自SEQ IDNo.7～SEQ ID No.9中一条的下游引物，以及序列如下的探针：CAGGGCAACGGAAGATCACGCAGTACACGCGG[FAM

【技术实现步骤摘要】
一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法。

技术介绍

[0002]洋葱伯克霍尔德复合体细菌(Burkholderia cepacia Complex，BCC)是一类革兰氏阴性、非发酵需氧性表型相近的变形菌门β亚纲细菌总称，可在严苛、低营养的环境中存活。近些年发现，BCC可引起菌血症、尿路感染、脓毒性关节炎、腹膜炎、诱发囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)和慢性肉芽肿病等呼吸系统病的重要条件病原体，可导致感染人群和免疫缺陷病人群的高死亡率。由于BCC具有多种毒力因子、天然的抑菌剂和抗生素的多重耐药性，也是导致医疗机构和护理机构内部感染的重要病原菌之一。在药品、护理产品、化妆品、食品和消毒剂等以水为主要基质的产品中都发现污染BCC，并导致了世界范围的产品召回和院内感染事件。非无菌药品中72％的产品召回是由不可接受微生物导致的，其中由BCC造成的非无菌产品召回比例达到22％。美国药典已将BCC列为非无菌药品中不可接受微生物(objectionable organism)。
[0003]目前，已知BCC内已有20多个种，其中常见种按基因型分成9个群，即genomovar I
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IX，分别为B.cepacia(genomovar I)、B.multivorans(genomovar II)、B.cenocepacia(genomovar III)、B.stabilis(genomovar IV)、B.vietnamiensis(genomovar V)、B.dolosa(genomovar VI)、B.ambifaria(genomovar VII)、B.anthina(genomovar VIII)和B.pyrrocinia(genomovar IX)。传统的培养法需要4
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7天才培养能得到供鉴定用的BCC菌落，通过增菌培养后的血清学、生化反应、色谱或质谱、红外光谱等方法对BCC进行鉴定，方法耗时费力。由于BCC及其近缘种属内细菌的表型特性十分接近，针对微生物表型检测的方法缺乏相应的灵敏性和准确性，因此，快速、灵敏的筛选方法在BCC的检测中显得尤为重要。而采用特异性基因靶点检测的分子检测方法更具优势等。与传统变温检测的方法相比，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)可在较低温度(38℃
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42℃)以恒温扩增方式检测目标核酸，给致病菌的核酸快速检测提供了反应温度低、检测时间短的高灵敏快速方法。
[0004]BCC检测常用的基因位点为16S rDNA、recA、fur和hisA基因，这些基因在不同BBC菌种内有较大的多态性，更适用于菌株的基因分型。目前，缺少用于快速筛查BCC的基因突变位点少、且相对保守的特异性基因靶点。随着测序技术的快速发展，微生物蛋白组和基因组序列资源越来越丰富，使得通过比较基因组学的方法可以更方便、更精确的筛选和确定目标微生物的特异性检测靶点。因此，有必要通过最新的目标基因挖掘策略，寻找新的适用于BCC快速检测的分子靶点，减少潜在的假阴性和假阳性检测结果，新的靶点挖掘也有助于对BCC中特异性蛋白和致病机理研究提供较好的基础。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点和恒温检测方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面是提供一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点，为secY基因。
[0008]本专利技术的第二方面是提供secY基因作为检测靶点在检测洋葱伯克霍尔德菌复合体中的应用。
[0009]本专利技术的第三方面是提供上述特异性检测靶点的扩增引物组合物，其包括序列选自SEQ ID No.1～6中一条的上游引物和序列选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.9中一条的下游引物，以及序列如下的探针：
[0010]CAGGGCAACGGAAGATCACGCAGTACACGCGG[FAM
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dT]A[THF][BHQ1
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dT]TCACCGTGGTGCTCG[C3Spacer]。
[0011]进一步地，引物组合物包括序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.7的引物对，或序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的引物对。
[0012]本专利技术的第四方面是提供包括上述引物组合物的洋葱伯克霍尔德菌复合体的检测试剂盒。
[0013]进一步地，上述试剂盒还包括反应预混液A、缓冲液B和灭菌纯化水。
[0014]本专利技术的第五方面是提供采用上述引物组合物或试剂盒的洋葱伯克霍尔德菌复合体的检测方法，该检测方法采用荧光RPA技术。
[0015]进一步地，上述检测方法采用的扩增体系为20μL，包括反应预混液A 10μL，10μmol/L上下游引物和探针各1μL，DNA模板1μL，含350mmol/L醋酸镁溶液的缓冲液B 2μL，余量为水。
[0016]进一步地，上述检测方法采用的反应条件为：39℃恒温反应20min，每30s采集一次荧光信号，共40个循环。
[0017]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0018]1.本专利技术首次发现的secY基因对BCC具有良好的特异性，可有效区分BCC与其他相关近似种。采用计算机模拟对已知的22种BCC蛋白组序列和基因组序列的验证，和对常见的9种BCC的检测和人工污染试验，证实了secY基因的特异性和荧光RPA方法的可靠性。
[0019]2.荧光RPA反应在镁离子存在的条件下，在39℃迅速启动，20min内完成，可实现高通量和便捷化的测试结果。荧光RPA法可在20min内检测BCC菌体灵敏度为5.6
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103CFU/mL，基因组检测灵敏度为12pg/μL。方法的包容性和排他性均为100％。
[0020]3.以人工污染的12批药品和21批化妆品对荧光RPA方法进行评价。与标准的培养法相比，荧光RPA方法的相对正确度和相对检出水平均为100％，在人工污染样品中可检测约1CFU/样品的BCC污染。
[0021]综上，本专利技术通过对不同BCC菌株蛋白组的比较，筛选出特异性检测靶点secY基因，并提供了针对该基因的荧光RPA引物与探针，开发了特异性的BCC的高通量、快速筛查和检测方法；该方法准确性高、特异性强、灵敏度高，适用于医疗机构、药品和医疗器械生产企
业、化妆品生产企业和相关检测机构的日常筛查工作。
附图说明
[0022]图1是本专利技术一实施例中挖掘洋葱伯克霍尔德菌复合体特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种洋葱伯克霍尔德菌复合体的特异性检测靶点，其特征在于，为secY基因。2.secY基因作为检测靶点在检测洋葱伯克霍尔德菌复合体中的应用。3.一种如权利要求1所述的特异性检测靶点的扩增引物组合物，其特征在于，包括序列选自SEQ ID No.1～6中一条的上游引物和序列选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.9中一条的下游引物，以及序列如下的探针：CAGGGCAACGGAAGATCACGCAGTACACGCGG[FAM
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dT]A[THF][BHQ1
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dT]TCACCGTGGTGCTCG[C3Spacer]。4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，包括序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.7的引物对，序列为SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：范一灵，王淑娟，宋明辉，杨燕，秦峰，杨美成，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：