一种蛋白酶K的冷冻干燥保护剂及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白酶K的冷冻干燥保护剂及制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术将Ca

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白酶K的冷冻干燥保护剂及制备方法


[0001]本专利技术涉及一种蛋白酶K的冷冻干燥保护剂及制备方法，属于生物


技术介绍

[0002]蛋白酶K是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，是林伯氏白色链球菌(Tritirachium album Limber)产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Kerantin)为唯一碳氮源的环境中生长，故被称作蛋白酶K。
[0003]蛋白酶K具有高效的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所特有的典型催化三联体Asp39
‑
His69
‑
Ser224特征并且活性中心周围有两个Ca
2+
结合位点增加其稳定性，使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。
[0004]蛋白酶K除含有两个Ca
2+
结合位点有助于稳定蛋白构象外，内部结构还存在两对二硫键，因此蛋白酶K比其他枯草杆菌蛋白在极端pH和高温环境下有更高的稳定性。利用这个特性，蛋白酶K在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域都有着重要的应用。
[0005]冷冻干燥技术是把含有水分的物料预先进行降温，冻结成冰点以下的固体，在真空条件下使冰直接升华，以水蒸气形式除去，从而得到干燥产品的一种技术。
[0006]冷冻干燥是在低温及真空状态下完成对制品的脱水干燥，有着其他干燥方式不具有的优点，逐渐成为生物制品中首选的干燥储存方法。主要体现在以下几个方面：制剂在预冻前完成分装，保证剂量的精确性；制品不易发生氧化和热变性，最大限度了保证原有理化性质和生物特性；固态的冰晶升华成为水蒸气后形成的疏松多孔结构，冻干制品具有良好的速溶性和复水性；易进行无菌操作，最大程度的减小微生物污染；脱水彻底，重量轻，方便储存和运输。
[0007]由于冻干过程是一个复杂的相变过程，蛋白酶K作为一种蛋白质，在冷冻干燥过程中极易受到冻干过程的低温效应、冻结效应和脱水效应的影响，最终导致其酶活性的降低甚至失活。因此为了减少蛋白酶K酶活性在冻干过程中的损伤，筛选合适的冻干保护剂尤为重要。
[0008]申请人检索的背景文献情况如下：
[0009]公开号为CN10717757A的专利文献中公开了一种蛋白酶K的冻干工艺，该专利的目的是采用新的冻干程序对蛋白酶K进行冻干，并未提及使用何种保护剂及添加量；公开号为CN102839165B的专利文献中公开了一种基因突变型重组蛋白酶K的工业化生产方法，该专利利用毕赤酵母生产制备蛋白酶K发酵液，经纯化冻干制成干粉制剂，但该专利也未提及使用何种保护剂及添加量。现有技术中公开的一些酶的冻干保护剂通常需要10余种配方才能够达到较为稳定的保护效果，调配过程繁琐。因此，筛选配方简单，有助于延长酶的储存时间并保持酶制剂良好外观的冻干保护剂配方尤为重要。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供了一种蛋白酶K的冷冻干燥保护剂及制备方法，通过配方筛选和优化，所得到的蛋白酶K酶粉具有酶活力高、热稳定性好、储存时间长、外观良好的特性。
[0011]本专利技术提供了蛋白酶K的冻干保护剂，含有蔗糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、甘氨酸、L
‑
丝氨酸、α
‑
丙氨酸、PEG6000、PEG8000、BSA、甘油中的一种或多种；所述蔗糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、甘氨酸、L
‑
丝氨酸、α
‑
丙氨酸、PEG6000、PEG8000或BSA的终浓度分别为3～30g/L；所述甘油的终浓度为3～30％。
[0012]在一种实施方式中，所述冻干保护剂还含有终浓度为0.2～200mM的Ca
2+
；所述Ca
2+
以盐的形式加入，包括但不限于氯化钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙中的一种和几种复配添加到配方中。
[0013]在一种实施方式中，所述冻干保护剂含有(a)～(j)中的任一种：
[0014](a)15g/L蔗糖，15g/L海藻糖；5mM Ca
2+
；
[0015](b)15g/L蔗糖，15g/L甘氨酸；5mM Ca
2+
；
[0016](c)15g/L蔗糖，15g/L丝氨酸；5mM Ca
2+
；
[0017](d)15g/L蔗糖，15g/L丙氨酸；5mM Ca
2+
；
[0018](e)15g/L海藻糖，15g/L甘氨酸；5mM Ca
2+
；
[0019](f)15g/L海藻糖，15g/L丝氨酸；5mM Ca
2+
；
[0020](g)15g/L海藻糖，15g/L丙氨酸；5mM Ca
2+
；
[0021](h)15g/L甘氨酸，15g/L丝氨酸；5mM Ca
2+
；
[0022](i)15g/L甘氨酸，15g/L丙氨酸；5mM Ca
2+
；
[0023](j)15g/L丝氨酸，15g/L丙氨酸；5mM Ca
2+
。
[0024]在一种实施方式中，所述冻干保护剂的添加量为蛋白质量的1％～100％，所述冻干保护剂用以减少蛋白酶K在冻干过程中活力的损失及增加蛋白质活力稳定性。
[0025]在一种实施方式中，所述冻干保护剂还含有酸碱调节剂。
[0026]在一种实施方式中，所述酸碱调节剂的浓度为2～100mM，缓冲能力在pH 4.0～8.0之间，所述酸碱调节剂包括但不限于乙酸
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乙酸钠缓冲液、柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸
‑
氢氧化钠
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盐酸缓冲液、Tris
‑
盐酸缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液。所述缓冲液用以维持蛋白酶K在其最适pH条件从而保证其最大催化活性。
[0027]本专利技术还提供了所述冻干保护剂在制备蛋白酶K冻干粉中的应用。
[0028]在一种实施方式中，所述蛋白酶K冻干粉按如下方法制备：
[0029](1)配制蛋白酶K和冻干保护剂的混合物，使溶液体系中蛋白酶K浓度为1～80mg/mL，冻干保护剂的添加量为蛋白质量的1％～100％；
[0030](2)将步骤(1)配制的混合物冻干。
[0031]在一种实施方式中，所述步骤(1)的混合物是在50mM HEPES缓冲液中，含有蔗糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、甘氨酸、L
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丝氨酸、α
‑
丙氨酸、PEG6000、PEG8000、BSA、甘油中的一种或多种；所述蔗糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、甘氨酸、L
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丝氨酸、α
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丙氨酸、PEG6000、PEG8000或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白酶K的冻干保护剂，其特征在于，含有终浓度≥0.2mM的Ca
2+
，及蔗糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、甘氨酸、L
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丝氨酸、α
‑
丙氨酸、PEG6000、PEG8000、BSA、甘油中的一种或多种；所述蔗糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、甘氨酸、L
‑
丝氨酸、α
‑
丙氨酸、PEG6000、PEG8000或BSA的终浓度分别为3～30g/L；所述甘油的终浓度为3～30％。2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，Ca
2+
终浓度为0.2～50mM。3.根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征在于，所述Ca
2+
以盐的形式加入，所述盐的形式包括但不限于氯化钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙中的一种或几种的复配。4.根据权利要求1～3任一所述的冻干保护剂，其特征在于，含有(a)～(j)中的任一组：(a)蔗糖，海藻糖，Ca
2+
；(b)蔗糖，甘氨酸，Ca
2+
；(c)蔗糖，丝氨酸，Ca
2+
；(d)蔗糖，丙氨酸，Ca
2+
；(e)海藻糖，甘氨酸，Ca
2+
...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗漫杰，施婧妮，雷宵，宫安，王梁，鄢文琪，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：