一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白I型的方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白I型的方法和应用。该方法以多巴胺和酚(1,3

【技术实现步骤摘要】
一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白I型的方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种基于铜离子触发的波长可调实时原位荧光免疫分析传感平台的构建及其分析应用，用于实时灵敏的检测cTnI，属于纳米生物传感


技术介绍

[0002]碱性磷酸酶(ALP)是一种膜结合酶，广泛表达于肝、骨、肠、胎盘、肾脏等组织。它主要负责从各种蛋白质和非蛋白质底物中水解和转化磷酸单酯。作为公认的生物标志物，碱性磷酸酶在细胞周期生长、凋亡和信号转导途径等许多重要的生理和病理过程中发挥着重要作用。成人血清ALP正常值一般在46～190U/L，儿童和孕妇ALP正常值在500U/L以上，但血清ALP异常与骨病、肝功能障碍、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、糖尿病等疾病密切相关。
[0003]此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定(ELISA)中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。目前，有多种方法用于检测ALP，例如：比色法、化学发光法、电化学发光法及表面增强共振拉曼散射等方法。上述的方法存在一些不足：复杂的步骤，低灵敏度及长的响应时间。因此，实现对多巴胺和碱性磷酸酶的高选择性和高灵敏度检测将有利于临床相关疾病的诊断、监测与治疗。
[0004]为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤开发了一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用，该检测方法兼具实时检测、快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。

技术实现思路

[0005]本专利技术解决的技术问题是：提出一种基于铜离子引发的原位荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)活性的方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案是：一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，铜离子催化多巴胺和酚(1,3
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萘二酚、8
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羟基久洛尼定、1,5
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萘二酚)发生原位荧光反应生成的蓝/绿/黄光发射的荧光化合物有助于构建多通道荧光酶联免疫传感平台，而焦磷酸根和铜离子离子具有较高亲和力使得荧光强度高、稳定性好的LFC波长可调荧光化合物(FCs)/Cu
2+
体系的荧光降低，向FCs/Cu
2+
系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根据荧光强度的变化以此来检测碱性磷酸酶。
[0007]优选的，FCs合成条件为：Tris
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HCl缓冲溶液的pH为7.4，多巴胺和1,3
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萘二酚、8
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羟基久洛尼定、1,5
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萘二酚的浓度为300μM，铜离子和PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0
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1250mU/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5小时；取孵化后溶液加入FCs/Cu
2+
体系，充分振荡；焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根
对铜FCs/Cu
2+
体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力，根据荧光强度的变化，以此定量检测碱性磷酸酶。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术提出另一技术方案是：所述的铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶方法制备的试剂盒。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术提出另一技术方案是：一种利用所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法。首先，一系列捕获抗体被注入到孔板中4℃孵化过夜；接着加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后加入不同浓度的cTnI溶液，取山羊抗/Ab2移入孔板中，加入反应体系，从而构成三明治式夹心免疫；最后在孔板中加入FCs/Cu
2+
；通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于检测心肌钙蛋白I型。
[0010]优选的，首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗数次，然后加入Tris
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HCl缓冲液，ALP标记的驴羊二抗和焦磷酸钠盐37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对FCs/Cu
2+
；通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于检测心肌钙蛋白I型。
[0011]优选的，该传感平台条件为：Tris
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HCl缓冲溶液的pH为9.0，Tris
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HCl的浓度为10mM，多巴胺和1,3
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萘二酚、8
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羟基久洛尼定、1,5
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萘二酚的浓度为300μM，铜离子和PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0
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1250mU/mL，ALP标记的驴羊二抗与焦磷酸钠盐的孵化温度为37℃，孵化时长为0.5h，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL,ALP标记的二抗浓度为2μg/mL,通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度检测，以此定量实时检测心肌钙蛋白I型。
[0012]为了解决上述技术问题，本专利技术提出另一技术方案是：所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的应用，在用牛血清蛋白封闭结束后，加入含有不同浓度心肌钙蛋白I型37℃孵化1小时；结束后再按照上述步骤，最后再加多巴胺和高锰酸钾，混合均匀后立即在荧光光谱仪中测试；先用心肌钙蛋白标准试剂盒测试出不同血清样本中心肌钙蛋白I型的含量，之后再根据前面测试标准曲线对样品进行稀释使其浓度在曲线范围内，稀释倍数为10倍，之后将其加入96孔板中37℃孵化1小时，再按照上述步骤进行试验；根据形成的FCs的荧光强度，用于病人血清样本中心肌钙蛋白I型的检测试剂盒的制备。
[0013]为了解决上述技术问题，本专利技术提出另一技术方案是：任一所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的制备的于定量检测心肌钙蛋白的商业试剂盒。
[0014]一种基于铜离子引发的原位荧光酶联免疫传感平台的构建，用于检测碱性磷酸酶(ALP)的方法，包括如下步骤：以多巴胺和8
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羟基久洛尼定为原料，在室温下通过水相氧化法制备了具有强荧光的荧光化合物HFO。该纳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：铜离子催化多巴胺和酚(1,3
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萘二酚、8
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羟基久洛尼定、1,5
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萘二酚)发生原位荧光反应，生成的蓝/绿/黄光发射的荧光化合物有助于构建多通道荧光酶联免疫传感平台，而焦磷酸根和铜离子具有较高亲和力使得波长可调荧光化合物(FCs)/Cu
2+
体系的荧光降低，向FCs/Cu
2+
体系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根离子，根据荧光强度的变化来检测碱性磷酸酶。2.根据权利要求1所述的铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：FCs合成条件为：Tris
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HCl缓冲溶液的pH为7.4，多巴胺和1,3
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萘二酚、8
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羟基久洛尼定、1,5
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萘二酚的浓度为300μM，铜离子和焦磷酸PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0
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1250mU/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5小时；取孵化后溶液加入FCs/Cu
2+
体系，充分振荡；焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对体系的淬灭作用，根据体系荧光强度的变化检测碱性磷酸酶活性。3.根据权利要求1或2所述的铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶方法制备的试剂盒。4.一种利用权1所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列捕获抗体被注入到孔板中4℃孵化过夜；接着加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后加入不同浓度的cTnI溶液，取山羊抗/Ab2移入孔板中，加入反应体系，从而构成三明治式夹心免疫，最后在孔板中加入FCs/Cu
2+
，通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于心肌钙蛋白I型检测。5.根据权利要求4所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，孙玉洁，庞丽华，常进，于海东，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：