通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法制造技术

在一个实施方式中，本发明专利技术提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求2019年02月02日提交的美国临时专利申请号62/800,484的权益，其通过引用并入本申请。
[0003]序列表
[0004]与本文同时提交的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0005]杜氏肌营养不良症(DMD)是一种由肌营养不良蛋白基因突变引起的致命的X连锁遗传疾病。其是最常见的遗传性肌肉病症。心力衰竭是DMA患者过早死亡的主要原因。炎症是DMD在进行性肌肉变性中的次要病理机制，而NF
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kappaB(NF
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κB)的抑制可减轻DMD小鼠的肌肉炎症、改善肌肉病理并改善肌肉生理功能(Yang,2012和Yin,2017)。
[0006]基于基因治疗的基因置换是DMD的潜在治疗方法(Wang,2000)，但DMD尚无治愈的方法。由NF
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κB信号转导上调引起的慢性炎症对DMD的基因疗法造成挑战(Mendell JR,2010 The NEJM)。通用启动子如CMV启动子经常在肌肉基因治疗中引起不希望的毒性和免疫应答。因此，特定的肌肉靶向基因递送系统对于DMD临床试验的安全性很重要(Wang,2008)。此外，鉴于充血性心力衰竭是DMD引起的主要并发症，用于DMD治疗的肌肉特异性表达迷你肌营养不良蛋白应导致在骨骼肌和心肌中迷你肌营养不良蛋白的强烈表达。
[0007]已经证明通过shRNA技术减少NF
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κB可以改善mdx小鼠的这种病理过程(Yang,2012)。其他初步结果还表明，当两种分别携带迷你肌营养不良蛋白和NF
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κB/p65
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shRNA的重组腺相关病毒(AAV)载体同时注射进入DMD小鼠模型中时，通过减少NF
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κB显著增加迷你肌营养不良蛋白的表达。然而，两种AAV注射在很多应用中过于复杂而无法应用于临床。
[0008]因此，需要一种在骨骼肌和心肌中同时引入迷你肌营养不良蛋白基因和NF
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κB/p65
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shRNA的更实用的载体。

技术实现思路

[0009]在一个实施方式中，本专利技术提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF
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κB/p65
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shRNA基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(AAV)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的Mcken(MCK)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述NF
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κB/p65
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shRNA基因是在第二启动子的控制下。还提供了包含此类基因载体的药物组合物和使用此类基因递送载体和药物组合物改善杜氏肌营养不良症(DMD)的方法。
[0010]不存在类似的技术。在DMD中上调的NF
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kB通路，不仅在下游发病机制中起关键作用(Acharyya 2007J Clin Invest)，而且还显著影响肌营养不良蛋白基因置换的效率(Jayandharan,2011PNAS)。双重治疗基因疗法策略是创新的，应该比单一的迷你肌营养不良蛋白置换有更多获益。
附图说明
[0011]图1A描述了单一和双重表达盒AAV构建体的示意图。图1B描述了在心脏组织中检测的肌营养不良蛋白的Western印迹。图1C描述了在心脏和肝脏组织中肌营养不良蛋白的免疫荧光(IF)染色。图1D描述了在来自使用双重表达盒AAV和单一表达盒AAV治疗全身性治疗的mdx/utrn
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小鼠的心脏组织、骨骼肌组织(DIA是膈肌，GAS是腓肠肌，TA是胫骨前肌)和肝脏组织中迷你肌营养不良蛋白的IF染色。迷你肌营养不良蛋白在单一homo和双重homo组的心脏、膈肌、GAS和TA肌肉中均成功表达。此外，在肝脏组织中无迷你肌营养不良蛋白表达，表明其具有组织特异性。图1E是显示在不同类型组织中迷你肌营养不良蛋白阳性细胞比的图。在单一homo和双重homo组之间在心脏和DIA组织中不存在差异。但是，双重homo组在GAS和TA肌肉中具有高得多的迷你肌营养不良蛋白。(****平均值p<0.0001)
[0012]图2A描述了在腓肠肌中CD68、CD4、CD8和p
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P65的IF染色。图2B描述了在心肌和腓肠肌中p
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P65的IF染色。WT：野生型，双重同源：双重表达盒AAV治疗的dKO
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homo，单一homo：单一表达盒AAV治疗的dKO
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homo，Ct
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homo：未经治疗的dKO
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homo。放大倍数：200x。(*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)
[0013]图3A代表在实施例2中讨论的转基因和敲低小鼠的特征。图3B描述了在2月龄的GAS肌肉中肌营养不良蛋白和p
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P65表达的Western印迹。图3C描述了在相同月龄的GAS肌肉中进行的肌营养不良蛋白和β
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肌聚糖的苏木精和伊红(H&E)染色，以及IF染色。
[0014]图4A描述了在2月龄转基因和敲低小鼠的腓肠肌中mIgG、CD68、CD4和CD8的Masson三色染色和IF染色。图4B显示的统计分析表明，CD68、CD4和CD8在不同转基因和敲低小鼠的组之间显示出显着差异。*p<0.01，**p<0.001和***p<0.0001。图4C描述了在rAAV治疗的心肌和/或腓肠肌中CD8、CD4和CD68的IF染色结果(在心脏组织中几乎无CD8阳性)。在下图中，Y轴是每个视觉帧的阳性细胞数。单一homo具有比Ct homo组更少的免疫细胞浸润，以及双重homo具有比单一homo组更少的免疫细胞浸润。(n＝3，*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)。图4D描述了AAV治疗小鼠的总体健康状况，其中(1)表示WT，(2)表示双重homo，(3)表示单一homo和(4)表示Ct homo。上图显示了在1月龄和2月龄的肌肉功能，频率为0至200HZ。下图显示了在1月龄和2月龄不同组的体重(*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)。
[0015]图5A是表示本专利技术的实施方式的示意性载体图：载体pAAV
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M1p65Ensyn本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF
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κB/p65
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shRNA基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(AAV)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的Mcken(MCK)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述NF
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κB/p65
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shRNA基因是在第二启动子的控制下。2.根据权利要求1所述的基因载体，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:23的序列。3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因包含SEQ ID NO:2
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13任一项的序列或其功能性变体。4.根据权利要求1所述的基因载体，其包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的序列。5.根据权利要求1或权利要求4所述的基因载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因包含SEQ ID NO:3
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6、8
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13和27任一项的序列或其功能性变体。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的基因载体，其中所述经修饰的MCK启动子增强子包含SEQ ID NO:14的序列或其功能性变体。7.根据权利要求1
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5中任一项所述的基因载体，其中所述肌肉特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冰，傅浩强，
申请(专利权)人：联邦高等教育系统匹兹堡大学，
类型：发明
国别省市：