鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法技术

本发明专利技术公开了鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法。所述的用于检测幽门螺杆菌的分子靶标，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所提及的分子靶标及检测方案特异性明显优于目前临床通用的Clayton方案，检测效能与Kim提出的高通量测序检测方案类似，但较Kim方案具有可定量、操作简便快捷、检测费用低廉的优点。检测费用低廉的优点。检测费用低廉的优点。

【技术实现步骤摘要】
鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法


[0001]本专利技术属于幽门螺杆菌检测领域，具体涉及鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，与人类胃肠道疾病有关。据统计，大部分消化道溃疡及消化道出血与该菌感染有关，且全球约90%的胃癌发病与HP感染密切相关，可见HP感染严重威胁人类的健康、造成了巨大的经济与社会损失。因此亟需一种精准高效的HP检测方案用于对临床上HP感染的检测，这将有利于提高感染高危人群的识别，对防控HP相关疾病有重要的意义。
[0003]HP是一种在体外生长缓慢、对培养基营养成分及培养环境要求都极为严苛的细菌，是学界公认的难培养微生物。为绕开HP培养学的技术瓶颈、解决庞大的临床检测需求，科学家们研发了各类不依赖于培养学方法的HP检测方案，其中以上世纪90年代英国学者Clayton专利技术的检测方案最为广泛应用。由于当时学界普遍认为HP是唯一一种能通过分泌脲酶适应胃部高酸环境的微生物，因此Clayton团队根据HP的脲酶合成基因ureA设计了检测引物，采用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）方法了解胃内是否存在ureA基因，从而判定胃粘膜是否存在HP（C Clayton, et al. 1991）。后续研究者们又以脲酶为检测目标设计了抗原
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抗体检测、
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碳尿素呼气测试等方案，实现了无需培养即可检出HP。
[0004]随着新一代测序技术及培养组学技术的发展，科学家们逐渐认识到胃部存在除HP外的多种其他微生物。专利技术人在前期工作中通过扩增子测序、宏基因组测序及培养组学手段证实，胃内存在丰富多样的微生物，其中仅细菌的种类就分布于15个门、29个纲、55个目、112个科及189个属中。专利技术人在前期工作中也发现胃内的很多微生物同样具有合成脲酶的功能，包括链球菌、芽孢杆菌、葡萄球菌等。由于目前常用的HP检测方案以胃内微生物脲酶合成基因是否阳性作为判别有无HP存在的标准，胃内其它具脲酶合成能力的微生物将会引起检测的假阳性，导致HP感染的误诊。
[0005] 为解决目前非培养法带来的HP检测假阳性的问题，韩国学者Kim等在2015年提出了采用基于高通量测序的方法进行HP感染的诊断方案：采用高通量测序仪对胃部粘膜微生态进行扩增子测序，若HP的相对丰度高于1%则认为被检测者存在HP感染（Jaeyeon Kim, et al. 2015）。专利技术人在前期研究中采集了一批因
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C呼气试验阳性诊断为HP相关性胃炎患者的胃粘膜样品，同时采用Clayton及Kim的方法进行HP检测，结果发现Clayton的检测方案存在假阳性的问题（如图4所示）。但由于高通量测序存在实验操作繁复、检测费用高昂的问题，目前Kim提出的HP检测方案在临床上难以得到推广。因此，目前亟需一种简便、精准的HP检测方案以满足临床对于HP感染的诊治需求。

技术实现思路

[0006]为解决这一问题，本专利技术人采用扩增子测序、宏基因组测序联合培养组学的方法探明了胃内存在的主要细菌种属，并联合其他中心的检测数据，绘制了胃部微生态组成谱图。基于胃部微生态组成的主要微生物组群的基因组数据库，专利技术人采用泛基因组分析手段，挖掘具有鉴别HP与其它胃内微生物作用的分子靶标，设计并优化了根据这一靶标的定性及定量检测方案。
[0007]本专利技术根据原核生物泛基因组自动化分析软件（Pan
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Genomics Analysis Pipeline，PGAP）中的MP方案获得HP的核心基因组信息。比对其它胃内存在的微生物基因组信息，提取HP特有基因的蛋白序列，后通过Blast分析比对NCBI数据库中非冗余蛋白数据库，去除能比对至其它物种基因的蛋白序列，获得HP的特异性分子靶标，包括核苷酸序列SEQ ID NO.1及氨基酸序列SEQ ID NO.2提供的分子序列，用于识别样本中是否存在HP。
[0008] 本专利技术的第一个目的是提供一组用于检测幽门螺杆菌（HP）的分子靶标，所述分子靶标包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一组用于检测上述分子靶标的引物组及其扩增产物，应用所述如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示引物对含HP的样本进行PCR扩增，可获得特异的299bp大小的产物，其序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]可通过上述引物，利用PCR扩增技术实现快速检测HP。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
[0012] 优选地，所述试剂盒还包括：2
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PCR Mix、模板DNA和水。
[0013]本专利技术的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗方法的检测幽门螺杆菌的PCR检测方法，包括以下步骤：使用上述引物组对待检测样本进行PCR扩增，若扩增产物在299bp位置出现单一条带，则判定样品中含有HP，若未出现目标大小的条带，则判定样本中不含有HP。
[0014] 优选地，所述PCR反应，其反应体系是：2
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PCR Mix 12.5μL、10 μmol/L引物各1 μL、模板DNA 1μL、ddH20 9.5μL，反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s、56.5℃退火30s、72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。
[0015]本专利技术的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗方法的对样品幽门螺杆菌进行定量的qPCR检测方法，包括以下步骤：使用上述引物组对待检测样本进行qPCR扩增，对扩增结果进行分析读取样本中的幽门螺杆菌含量。
[0016]优选地，所述qPCR，其扩增体系为：2
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SYBR Green Premix 反应液5 μL，待测模板DNA 1uL，10 μmol/L引物各0.5 μL，水3μL；qPCR反应程序两步法PCR反应程序：95℃预热30s；两步法扩增95℃ 5s、60℃退火30s，共进行40个循环。
[0017]本专利技术的有益效果：经验证，本专利技术所提及的分子靶标及检测方案特异性明显优于目前临床通用的Clayton方案，检测效能与Kim提出的高通量测序检测方案类似，但较Kim方案具有可定量、操作简便快捷、检测费用低廉的优点。
[0018]因此，本专利技术公开了用于鉴别幽门螺杆菌的特异性检测靶标及相关的检测方法，
Kit v2.5（Illumina）测序试剂盒在Nextseq 550平台（Illumina）上进行测序。下机数据采用bcl2fastq软件进行数据拆分。
[0028]②
胃部微生态宏基因组数据的生物信息学分析：将下机数据导入CLC workbench（Qiagen）分析平台，采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测幽门螺杆菌的分子靶标，其特征在于，所述的分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一段可用于检测幽门螺杆菌的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2。3.一组用于检测权利要求1所述的分子靶标的引物组，其特征在于，包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。4.一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求3所述的引物组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：2
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PCR Mix和水。6.一种非疾病的诊断和治疗方法的检测幽门螺杆菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求3所述的引物组对待检测样本进行PCR扩增，若扩增产物在299bp位置出现单一条带，则判定样品中含有HP，若未出现目标大小的条带，则判定样本中不含有HP。7.根据权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应，其反应体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李滢，吴清平，庞锐，商燕燕，谢新强，陈慧贞，薛亮，陈谋通，杨润时，王涓，丁郁，张菊梅，陈惠元，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：