一种外周血NKT细胞培养液及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血NKT细胞培养液及培养方法，该NKT细胞培养方法包括步骤：将外周血单个核细胞加入含细胞因子的自体血清的淋巴细胞无血清培养基中培养14天左右；培养期间，每隔2~3天需要添加含细胞因子的培养液；培养结束后，经离心处理和0.9%的氯化钠溶液清洗，得到外周血NKT细胞；向外周血NKT细胞中加入人血清白蛋白后并用0.9%的氯化钠溶液定容，获得外周血NKT细胞。该培养方法，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；NKT细胞生长快、扩增倍率高；NKT细胞杀伤活性高，具有较强的肿瘤细胞杀伤作用。具有较强的肿瘤细胞杀伤作用。具有较强的肿瘤细胞杀伤作用。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血NKT细胞培养液及培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞学领域，尤其涉及一种外周血NKT细胞培养液及培养方法。

技术介绍

[0002]NKT 细胞（natural killer T Cell），是一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是介导细胞毒活性最强的免疫细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞非主要组织相兼容复合物（MHC）的限制性杀瘤效应。NKT 细胞其具有增殖速度快、杀瘤活性高等优点。
[0003]现阶段而言，NKT细胞培养是将分离的外周血血单个核细胞( PBMC )用IFN
‑
γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL
‑
1α和IL
‑
2因子进行刺激诱导，获得一定数量的NKT细胞，但最终获得的NKT细胞中有效细胞含量纯度低、细胞杀伤活性弱、且细胞扩增倍率相对不高。

技术实现思路

[0004]基于上述问题，本专利技术所要解决的问题在于提供一种高纯度、高扩增倍数的外周血NKT细胞培养液及培养方法。
[0005]本专利技术的技术方案一如下：一种外周血NKT细胞培养液，包括含1~20v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，在该培养基中添加细胞因子：10~3000IU/ml的IL
‑
2、5~500ng/ml 的IL
‑
15、5~500ng/ml 的IL
‑
18、5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、0.01~5ng/ml的达沙替尼及5~500IU/ml 的POM。
[0006]较好地，一实施例中，NKT细胞培养液包括含10v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，在该培养基中添加细胞因子：1000IU/ml的IL
‑
2、50ng/ml 的IL
‑
15、50ng/ml 的IL
‑
18、200ng/ml 的CD3 单克隆抗体、2ng/ml的达沙替尼及100IU/ml 的POM。
[0007]本专利技术还提供一种外周血NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：S1、第0天，从外周血中分离出单个核细胞，将所述单个核细胞加入含1~20v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，并往该培养基中添加细胞因子，所述细胞因子包括浓度为10~3000IU/ml的IL
‑
2、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
15、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
18、浓度为5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、浓度为0.01~5ng/ml的达沙替尼及浓度为5~500IU/ml 的POM；静置培养14天；S2、第3和第5天，分别添加淋巴细胞无血清培养基及细胞因子，所述细胞因子包括浓度为10~3000IU/ml的IL
‑
2、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
15、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
18、浓度为5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、浓度为0.01~5ng/ml的达沙替尼及浓度为5~500IU/ml 的POM；；S3、第7天、第9天、第11天，分别添加淋巴细胞无血清培养基以及浓度为10~3000IU/ml的IL
‑
2细胞因子；S4、细胞培养结束后，将培养好的外周血NKT细胞转移到离心管中进行离心处理后，收集外周血NKT细胞并用0.9%的氯化钠溶液反复洗涤2~3次；S5、往步骤S5的洗涤后获得的外周血NKT细胞中加入人血清白蛋白，并用0.9%的氯
化钠溶液定容，得到所述外周血NKT细胞。
[0008]较好地，所述培养方法的步骤S1中，所述自体血清是经过56℃灭活过的自体血清，浓度为1
‑
20v/v%。
[0009]较好地，所述培养方法的步骤S1和S2中，所述细胞因子中，IL
‑
2的浓度为1000IU/ml、IL
‑
15的浓度为50ng/ml、IL
‑
18的浓度为50ng/ml、CD3单克隆抗体的浓度为200ng/ml、达沙替尼的浓度为2ng/ml及POM的浓度为100IU/ml。
[0010]较好地，所述培养方法的步骤S3中，所述IL
‑
2的浓度为1000IU/ml。
[0011]较好地，所述培养方法中，所述淋巴细胞无血清培养基包括GT
‑
T551H3培养基、CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基及RPMI
‑
1640培养基中的任一种较好地，所述培养方法中，在所述细胞培养过程中，细胞浓度控制在1
×
107个/ml~2
×
107个/ml。
[0012]较好地，所述培养方法的步骤S5中，向外周血NKT细胞中加入体积百分比为10％的人血清白蛋白10 ml，并用0.9wt％的氯化钠溶液定容至200 ml。
[0013]与常规的培养方法相比，本专利技术的有益效果表现在以下几方面：( 1 )、单个核细胞的分离来源于外周血，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；( 2 )、培养出的NKT细胞纯度高、生长快且扩增倍率高；( 3)、培养出的NKT细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果；因此，细胞因子达沙替尼和POM在细胞培养的持续加入中，能够促进NKT细胞的激活，对NKT细胞的CD3+CD56+流式含量有较大的促进作用，从而有效提升NKT细胞的杀瘤活性。
附图说明
[0014]图1为本专利技术中实施例1、实施例2、实施例3与对比例的外周血免疫细胞NKT生长曲线图；图2为本专利技术中实施例1、实施例2、实施例3与对比例的外周血免疫细胞NKT扩增倍率曲线图；图3为本专利技术中实施例1、实施例2、实施例3与对比例的外周血免疫细胞NKT对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；图4a、4b、4c、4d分别为本专利技术中实施例1、实施例2、实施例3与对比例的外周血免疫细胞NKT培养14天后的CD3+CD56+表型检测图。
具体实施方式
[0015]下面结合附图，对本专利技术的较佳实施例作进一步详细说明。
[0016]本专利技术中一些常用的术语说明如下：IL
‑
2：白细胞介素2；IL
‑
15：白细胞介素15；IL
‑
18：白细胞介素18；CD3单抗：细胞表面分子3单克隆抗体。
[0017]其中：IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
18、CD3单克隆抗体等作为NKT细胞培养的基础细胞因子，是NK、NKT细胞培养中不可或缺的；IL
‑
2：促进NKT细胞的生长、增殖；IL
‑
15和IL
‑
18：协同作用刺激诱导NKT细胞分化、增殖；CD3 单克隆抗体：刺激诱导NKT细胞的形成和产生细胞因子；达沙替尼：抑制T细胞的增殖，提高NKT细胞纯度, 增强N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血NKT细胞培养液，其特征在于，该细胞培养液包括含1~20v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，在该培养基中添加细胞因子：10~3000IU/ml的IL
‑
2、5~500ng/ml 的IL
‑
15、5~500ng/ml的IL
‑
18、5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、0.01~5ng/ml的达沙替尼及5~500IU/ml的POM。2.根据权利要求1所述的NKT细胞培养液，其特征在于，该培养液包括含10v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基，在该培养基中添加细胞因子： 1000IU/ml的IL
‑
2、50ng/ml 的IL
‑
15、50ng/ml的IL
‑
18、200ng/ml 的CD3 单克隆抗体、2ng/ml的达沙替尼及100IU/ml的POM。3.一种外周血NKT细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、第0天，从外周血中分离出单个核细胞，将所述单个核细胞加入含1~20v/v%自体血清的淋巴细胞无血清培养基中，并往该培养基中添加细胞因子，所述细胞因子包括浓度为10~3000IU/ml的IL
‑
2、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
15、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
18、浓度为5~1000ng/ml 的CD3 单克隆抗体、浓度为0.01~5ng/ml的达沙替尼及浓度为5~500IU/ml 的POM；静置培养14天；S2、第3和第5天，分别添加淋巴细胞无血清培养基以及细胞因子，所述细胞因子包括浓度为10~3000IU/ml的IL
‑
2、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
15、浓度为5~500ng/ml 的IL
‑
18、浓度为5~1000ng/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，谢海涛，谢炜豪，刘元甲，薛卫巍，
申请(专利权)人：东莞再立健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：