一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组枯草芽孢杆菌，其保藏编号为：CGMCC NO：23102。本发明专利技术通过将编码基因papA插入载体，转化宿主枯草芽孢杆菌，获得一株能够高产植物乳杆菌素papA的重组枯草芽孢杆菌CGMCC NO：23102。本发明专利技术重组枯草芽孢杆菌CGMCC NO：23102能够用于生产重组植物乳杆菌素papA，并且对单增李斯特菌有明显的抑制作用。作用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生态领域，特别涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]片球菌素（pediocin，PA
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1）是乳酸片球菌分泌的肽类细菌素，对食源性致病菌单增李斯特菌有抑制作用。北京农学院张红星教授等从腊肉中分离一株植物乳杆菌Zhang
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LL，对单增李斯特等菌有抑制作用（CN104531562B）。纯化后活性成分经分析确定为多肽，称植物乳杆菌素，全基因组测序序列分析，编码基因为papA，与片球菌素PA
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1序列一致。PA
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1/papA的前体肽包含前导肽和功能肽，成熟的功能肽包含44个氨基酸，分子量4.6 kDa，包含四个半胱氨酸残基，形成两个二硫桥。植物乳杆菌素/片球菌素在天然宿主菌表达水平有限，纯化较为困难。
[0003]为了提高片球菌素的表达量，研究者对PA
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1进行异源表达。目前在大肠杆菌表达PA
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1/papA的方法较为繁琐，这是由于PA
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1与papA都位于一个操纵子中，包含4个编码框，除了细菌素的功能基因，还包含一个免疫蛋白、一个具有氨基肽酶的ABC
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转运肽、和一个辅助蛋白，即片球菌的三个基因pedBCD，和植物乳杆菌的三个基因papBCD。在大肠杆菌中直接表达片球菌素，没有抑菌活性，必须整个操纵子一起加到载体上，才能得到有抑菌活性的表达上清(Mesa
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>Pereira, O'Connor et al. 2017)。而单独表达PA
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1的成熟肽，构建载体时，为了保持成熟肽的有效折叠，需要在papA基因之前加上硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）基因(Beaulieu, Tolkatchev et al. 2007, Liu, Han et al. 2011)、二氢叶酸还原酶基因（dihydrogolate reductase，DHFR）(Moon, Pyun et al. 2006)和绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）(Vermeulen, Van Staden et al. 2020)等基因，才能得到可溶性的融合蛋白。而融合蛋白没有抑菌活性，需要切除融合肽中的辅助肽（Trx、DHFR、GFP）后，papA的抑菌功能才能发挥。因此，构建新菌种，建立一种简单的PA
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1/papA异源表达的方法，尤为重要。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种“公认安全(generally recognized as safe, GRAS)”的食品级有益微生物，故选为本研究的出发菌株。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌B. subtilis DBN
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SKL
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PA2，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2021年8月2日，保藏编号为：CGMCC NO： 23102，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0005]本专利技术的另一目的是提供了一种表达植物乳杆菌素papA的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，具体为将核酸序列如SEQ ID NO. 1所示的DNA与线性化的表达载体连接后转入宿主枯草芽孢杆菌中获得；所述SEQ ID NO. 1所示的核酸序列编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0006]所述核酸序列SEQ ID NO. 1具体为：AAATACTACGGTAATGGGGTTACTTGTGGCAAACATTCCTGCTCTGTTGACTGGGGTAAGGCTACCACTTGCATAATCAATAATGGAGCTATGGCATGGGCTACTGGTGGACATCAAGGTAATCATAAATGCTAG；编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO. 2具体为： KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC。
[0007]进一步，所述宿主枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B. subtilis WB800N；进一步，所述重组蛋白的表达载体是大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHT43。
[0008]本专利技术还提供了使用所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO：23102制备细菌素papA的方法，具体为：将所述的重组枯草芽孢杆菌划线于含氯霉素的2YT固体培养基上活化，30
‑
40℃倒置培养过夜；挑选菌落接种于2YT液体培养基中，30
‑
40℃，180
‑
250 rpm培养过夜；随后按照体积百分比1
‑
2%接种至含氯霉素的2YT液体培养基中，30
‑
40℃，180
‑
250 rpm培养2
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4 h；加入终浓度0.1
‑
1 mM的IPTG，28
‑
30℃，180
‑
250 rpm培养3
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8 h；培养结束后取菌液，10000
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12000 rpm离心15
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25 min，取上清，即为含植物乳杆菌素papA成熟肽的上清液。
[0009]本专利技术还提供了所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO：23102的大规模发酵方法，其中使用的培养基为：20 g/L的蛋白胨、16 g/L的酵母粉、5 g/L的NaCl2；发酵培养条件为：发酵温度28
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30℃，转速180
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250 rpm，优选200rpm，初始pH7.0。
[0010]本专利技术还提供了所述的重组枯草芽孢杆菌在制备抑制单增李斯特菌的药物或者饲料中的应用。
[0011]具体为：所述的重组枯草芽孢杆菌和/或其发酵后的上清液制备成抑制单增李斯特菌的药物，或者将所述的重组枯草芽孢杆菌和/或其发酵后的上清液添加到饲料中。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本研究构建papA的芽孢杆菌表达载体pHT43
‑
papA2，转化枯草芽孢杆菌重组菌株；经诱导表达，菌液离心，收集的表达上清液即对单增李斯特菌有抑制活性，省却了对重组蛋白的酶切等后续处理。该诱导表达的重组蛋白命名为PA2；抑菌实验表明，枯草芽孢杆菌表达的PA2对单增李斯特菌的抑制作用较植物乳杆菌Zhang
‑
LL好，表现为抑菌圈大。
附图说明
[0013]图1是大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌重组穿梭表达质粒pHT43
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papA2的构建示意图；图2是重组枯草芽孢杆菌DBN
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SKL
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PA2诱导表达上清液对单增李斯特菌的抑制实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC NO：23102。2.一种利用重组枯草芽孢杆菌表达植物乳杆菌素papA的方法，其特征在于，将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA与线性化表达载体连接后转入宿主枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌，培养所述的重组枯草芽孢杆菌并进行诱导表达，取上清。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800N。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述线性化表达载体为大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHT43。5.一种利用权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌表达植物乳杆菌素papA的方法，其特征在于，将所述的重组枯草芽孢杆菌划线于含氯霉素的2YT固体培养基上活化，30
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40℃倒置培养过夜；挑选菌落接种于2YT液体培养基中，30
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40℃，180
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250 rpm培养过夜；随后按照体积百分比1
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2%接种至含氯霉素的2YT液体培养基中，30
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40℃，180
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250 rpm培养2
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4 h；加入终浓度0.1
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1 mM的IPTG，28
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30℃，180
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250 rpm培养3
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【专利技术属性】
技术研发人员：王根宇，刘雪连，张雪倩，吴昊，张海亮，庞远祥，邓莉萍，高子昂，邵根伙，
申请(专利权)人：浙江大北农农牧科技有限公司江西大北农科技有限责任公司山东大北农农牧科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：