植酸酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种植酸酶突变体、其制备方法及应用、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞。本发明专利技术提供的突变体在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：36、126、211、253、258、266。所述突变体的耐热性均得到显著提高，从而有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。酸酶在饲料中的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
植酸酶突变体


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种植酸酶突变体、其制备方法及应用、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞。

技术介绍

[0002]植酸酶是一种能水解植酸的磷酸酶类。它能将植酸磷（六磷酸肌醇）降解为肌醇和无机磷酸。此酶分为两类: 3
ꢀ‑
植酸酶（EC. 3. 1. 3. 8）和 6
ꢀ‑
植酸酶（EC. 3. 1. 2. 6）。植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中, 如玉米、小麦等高等植物, 枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物中。
[0003]在谷物、豆类和油料等作物籽实中，磷的基本贮存形式是植酸磷，其含量高达 1%～3%，它占植物中总磷的 60%～80%。但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在 0%～40%，从而造成了许多问题：首先是造成磷源浪费，一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中添加无机磷, 提高了饲料成本；其次是形成高磷粪便污染环境。饲料中 85%左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的植酸磷使水和土壤受到严重污染。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如 Zn
2+
、Ca
2+
、Cu
2+
、Fe
2+
等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的有效利用。
[0004]植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提60%，粪便中磷排泄量减少40%，同时还可降低植酸的抗营养作用。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。
[0005]现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于大肠杆菌的细菌植酸酶两种。其中来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。
[0006]因为目前在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80
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90℃的高温阶段。细菌植酸酶APPA热稳定性较差，其水溶液在70℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，直接添加到动物饲料中进行制粒后存留酶活一般低于20%，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后植酸酶液喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高热稳定性对目前饲料用植酸酶具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供一种植酸酶突变体，获得突变体蛋白，提高其耐热性，从而有利于植酸酶在饲料领域的广泛应用。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
本专利技术涉及一种植酸酶突变体，其包含与SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:3相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：36，126，211，253，258，266。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0010]在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：A36P，N126E，V211W，Q253Y，Q258E，S266P。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：A36P，N126E，V211W，Q253Y，Q258E，S266P，A36P/V211W，A36P/Q253Y，V211W/Q253Y，A36P/V211W/Q253Y，A36P/N126E /V211W/Q253Y。
[0013]本专利技术还涉及编码上述植酸酶突变体的DNA分子。
[0014]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0015]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0016]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的植酸酶突变体的耐热性得到显著提升。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0019]本专利技术还提供了上述植酸酶突变体的制备方法，包括：步骤1：获取编码植酸酶突变体的DNA分子，所述植酸酶突变体包含与SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:3相比在选自下组中的至少一个位置上包含至少一种氨基酸的取代：36，126，211，253，258，266；步骤2：将步骤1获得的所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞；步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
[0020]在本专利技术的一些实施例中，步骤1所述的植酸酶突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：A36P，N126E，V211W，Q253Y，Q258E，S266P。
[0021]在本专利技术的一些实施例中，步骤2所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0022]在本专利技术的一些实施例中，步骤2所述的宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0023]本专利技术还提供了上述植酸酶突变体在饲料中的应用。
[0024]本专利技术以植酸酶APPA
‑
M0为基础，提供了包含A36P、N126E、V211W、Q253Y、Q258E、S266P中至少一个突变位点的突变体。与APPA
‑
M0相比，所述突变体在 80℃条件下处理5min后，酶活残留率普遍提高了8.9%
‑
121.2%，耐热性得到显著提高。其中，突变体PHY
‑
M2、PHY
‑
M3、PHY
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M7、PHY
‑
M9、PHY
‑
M10和PHY
‑
M11在85℃条件下处理5min后，酶活残留率仍能达到50.98
‑
74.60%，比APPA
‑
M0普遍提高了17.2%
‑
71.5%，耐热性更强。本专利技术提供的突变体耐热
性得到显著提高，有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述的突变体包含与SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:3相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：36，126，211，253，258，266。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求1所述的突...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，李馨培，李瑞，宋清清，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：