可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条制造技术

一种可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其包括底板、固定在底板上依次相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其结合垫中固定有由硫堇标记的标记抗体，是将硫堇通过戊二醛与单克隆抗体mAb1进行偶联形成的Thi

【技术实现步骤摘要】
可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条


[0001]本专利技术属于快速免疫检测
，具体涉及一种可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条。

技术介绍

[0002]目前，越来越多的检测技术应用于转基因作物的检测中。PCR是检测转基因作物特异性DNA的主要方法，但其操作繁琐，耗时长且需昂贵仪器，不适于现场检测。LAMP和RPA克服了PCR的弊端，能够快速，灵敏，高特异性的进行检测，但其采用琼脂凝胶电泳，耗时长且易污染，仍存在一定局限性。
[0003]以上基于核酸水平的检测，虽具有超高灵敏度，但在实际样品现场检测时仍存在一定弊端。基于外源蛋白水平的检测技术，能直观的对样品进行检测，在实际样品现场检测时呈现优势。ELISA是基于外源蛋白的常规检测方法，操作简单，特异性强，但其耗时长。免疫层析试纸条(Immunochromatographic strip，ICS)具有成本低，操作简单，检测时间短，样品处理简单等优点，已广泛应用于各个领域的快速检测中。目前，基于蛋白质检测的ICS方法十分有限，只有少数蛋白的试纸条可供选择，仍需不断做进一步的研究。
[0004]随着免疫学技术的不断发展，越来越多的材料作为信号标记物用于ICS的构建中，如纳米微粒，量子点，荧光微球等。标记物的不断更新，提高了ICS的检测灵敏度，但这些材料大多需要复杂的合成及改性过程。
[0005]胶体金等纳米材料作为显色信号广泛应用于试纸条的构建中，但需要复杂的抗体标记及材料改性过程，且一般灵敏度偏低，同时，传统胶体金试纸条在实际检测中，易受到样品基质，如血液及血色样品的影响，具有一定局限性；荧光材料也很多，如碲化镉量子点、上转换纳米材料，像这一类成本较高，需要借助小型发光源实现可视化。
[0006]因此，需要对试纸条的标记信号物做进一步改进，建立一种灵敏度高，操作简单，短时间检测的ICS对快速免疫检测法的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，以硫堇Thi作为信号标记物，无需合成，直接进行标记，标记过程仅需10min，简化了实验过程，不需要纳米材料，超简单，快速检测转基因蛋白CP4
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EPSPS，打破传统胶体金试纸条在实际样品检测中的局限性，为免疫层析试纸条的构建提供了新方向。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]一种可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其包括，底板、固定在底板上依次相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述结合垫中固定有由硫堇标记的标记抗体，所述标记抗体是转基因蛋白的捕捉抗体，是将硫堇通过戊二醛与单克隆抗体mAb1氨基以共价结合方式进行偶联形成的Thi
‑
mAb1复合物；
[0010]所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，硝酸纤维素膜近结合垫端包被单克隆
抗体mAb2，作为检测线，所述单克隆抗体mAb2是转基因蛋白的检测抗体；硝酸纤维素膜近吸水纸端包被羊抗鼠IgG抗体，作为质控线。
[0011]优选地，所述单克隆抗体mAb1和单克隆抗体mAb2是转基因蛋白CP4
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EPSPS的配对抗体。
[0012]优选地，所述结合垫上标记抗体的质量为0.3
‑
0.4μg。
[0013]又，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸相邻之间重叠1
‑
2mm。
[0014]进一步，所述试纸条还包括套设在底板外的外壳；所述外壳的壳体上开有加样孔和观察窗，所述加样孔设于对应所述样品垫上方的壳体处，所述观察窗设于对应所述硝酸纤维素膜上方的壳体处。
[0015]选择合适的信号标记物对ICS的构建十分重要，本专利技术首次选用小分子硫堇Thi作为信号标记物，建立了一种ICS用于转基因作物中CP4
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EPSPS蛋白的快速检测，Thi无需复杂改性过程，通过戊二醛交联作用，迅速与单克隆抗体mAb1偶联，仅需要10min，大大缩短了制备过程，同时，由于Thi呈现深紫色，打破了传统胶体金试纸条在实际样品(如，血色样品)检测中结果受样品颜色影响的局限性，为免疫层析试纸条的构建提供了新方向。
[0016]本专利技术中，基于经典的双抗体夹心模式构建了新型硫堇显色免疫层析试纸条，单克隆抗体mAb1和单克隆抗体mAb2是CP4
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EPSPS蛋白的配对抗体，在样品垫上方滴加样品，如果含有目标蛋白CP4
‑
EPSPS蛋白，随着样品迁移，CP4
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EPSPS蛋白与结合垫中的标记抗体结合形成耦合物继续迁移，被固载于T线的抗体捕获，过量耦合物相继与C线抗体结合，在试纸条中呈现清晰的两条肉眼可见紫色条带，并判定实验结果为阳性。如果样品中不含CP4
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EPSPS蛋白，标记抗体不能被T线抗体捕获而积累，直接与C线抗体结合，呈现一条清晰条带，并判定为阴性。综上所述，可通过肉眼快速读取检测结果，同时利用Image J软件对检测结果进行定量分析。
[0017]一种可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0018]1)准备PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫与结合垫经预处理并烘干备用；
[0019]2)将羊抗鼠IgG抗体和单克隆抗体mAb2分别固载于硝酸纤维素膜上，作为质控线C线和检测线T线；
[0020]3)在离心管中加入硫堇，通过戊二醛活化氨基与单克隆抗体mAb1进行偶联形成Thi
‑
mAb1复合物，终浓度为0.05
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0.1mg/mL；
[0021]4)将Thi
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mAb1复合物作为标记抗体滴加在结合垫上，37℃烘40min
‑
60min，接着，依次将于硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫及吸水纸组装在底板上重叠1
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2mm，切割。
[0022]优选地，步骤3)中，硫堇的浓度为0.5
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1mg/mL，Thi
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mAb1复合物的终浓度为0.05mg/mL，体积为6
‑
8μL；步骤4)中，将其滴加在结合垫上后于37℃烘40min，组装后的试纸切割成宽度为2.5
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3mm的条带。
[0023]又，步骤3)中，单克隆抗体mAb1与Thi的偶联时间为10min。
[0024]硫堇Thi作为实验中的标记信号，与特异性单克隆抗体mAb1的标记情况直接影响着检测线的信号强度和试纸条的灵敏度，Thi浓度过低时，检测信号较弱，当浓度过高时，会产生背景干扰现象，同时，过量Thi堆积于NC膜下方，阻碍样品迁移形成误差，阻碍检测线的
信号响应，因此，结合观察检测区域的信号强弱，综合信号产生能力及横向迁移行为，选择了Thi的最本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化快速检测转基因蛋白的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其包括，底板、固定在底板上依次相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述结合垫中固定有由硫堇标记的标记抗体，所述标记抗体是转基因蛋白的捕捉抗体，是通过戊二醛将硫堇与单克隆抗体mAb1氨基以共价结合方式进行偶联形成的Thi
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mAb1复合物；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，硝酸纤维素膜近结合垫端包被单克隆抗体mAb2，作为检测线，所述单克隆抗体mAb2是转基因蛋白的检测抗体；硝酸纤维素膜近吸水纸端包被羊抗鼠IgG抗体，作为质控线。2.根据权利要求1所述的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体mAb1和单克隆抗体mAb2是转基因蛋白CP4
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EPSPS的配对抗体。3.根据权利要求1或2所述的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫上标记抗体的质量为0.3
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0.4μg。4.根据权利要求1所述的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸相邻之间重叠1
‑
2mm。5.根据权利要求1所述的硫堇标记抗体免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括套设在底板外的外壳；所述外壳的壳体上开有加样孔和观察窗，所述加样孔设于对应所述样品垫上方的壳体处，所述观察窗设于对应所述硝酸纤维素膜上方的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金斌，曾海娟，杨倩雯，
申请(专利权)人：上海瑞丰农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：