一种无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法技术

本发明专利技术涉及一种无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法。DNA损伤检测与肿瘤、神经退行性疾病的发展具有密切的联系，现有DNA损伤的检测方法往往设计复杂的探针设计和标记方式，检测设备昂贵。本发明专利技术提供了一种无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，基于碱基切除修复(BER)途径和末端转移酶(TDT)启动的无模板等温循环扩增，实现了无标记和均相生物发光法检测基因组DNA中的单碱基损伤和聚集损伤。该检测方法具有良好的灵敏度，检测过程中无需分离及洗涤的步骤，能够显著节约检测程序，用于疾病的诊断或抗肿瘤活性成分的筛选具有重要意义。要意义。要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法


[0001]本专利技术属于DNA损伤检测
，具体涉及一种无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，基于该检测方法的试剂盒及所述检测方法、试剂盒在疾病诊断、抗肿瘤活性药物筛选领域的应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]保持基因组的完整性和稳定性对人类具有重要意义，细胞DNA不断受到各种内源性因素(如水解、活性氧和氮)和外源性因素(如X射线、紫外线和许多化学物质)的影响，每天在单个人体细胞中产生104‑
106个DNA损伤事件。基因组不稳定性在癌症、衰老和阿尔茨海默病中起着关键作用。最常见的DNA损伤是碱基、核糖和单链断裂损伤，这些损伤是由氧化、烷基化、脱氨基、自发水解等产生的。当这些损伤通过错误的修复或复制转化为突变时，将会是永久性的，并持续在后代细胞中引发一系列影响。突变的一个重要后果是肿瘤抑制基因的丢失和原癌基因的激活，导致细胞不受控制的增殖从而引发癌症。
[0004]DNA损伤有两种类型，包括单碱基的DNA损伤和聚集的DNA损伤。其中，聚集DNA损伤较难检测，因为聚集DNA损伤由两个或两个以上的损伤位点组成，这些损伤紧密地分布在DNA的一个或两个螺旋内。另外，由于损伤的丰度低、多样性大，位置随机，准确而特异的检测全基因组DNA损伤水平仍然是一个巨大的挑战。
[0005]目前，DNA损伤的检测方法有彗星法、酶联免疫吸附法、质谱法、高效液相色谱—质谱法、单分子检测法和荧光法等。彗星试验和酶联免疫吸附试验是目前最常用的方法，但它们费时、涉及多步分离、成本高。单分子检测具有灵敏度高的优点和原位成像DNA损伤的能力，但需要昂贵的实验设备。荧光法具有简单、快速、灵敏度高等优点，但涉及复杂的探针设计和昂贵的标记。与荧光法相比，生物发光法具有背景信号低、高通量、无需激发的自发光等显著优点，特别是其信号读出不受自荧光、散射光和光漂白的干扰。在生物体内，细胞具有多种修复机制来抵消DNA损伤的有害影响，如碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)等。BER是维持DNA稳定性最通用的途径，它可以修复由烷基化、氧化和脱氨基引起的各种DNA损伤。BER由DNA糖基化酶引发，糖基化酶识别受损和不匹配的碱基，并通过水解碱基和DNA主链之间的N
‑
糖苷键生成一个无碱基位点。每种损伤碱基都对应独特的DNA糖基化酶，DNA糖基化酶能区分特定的核碱基损伤。受DNA糖基化酶高特异性的启发，科学家发展了一系列检测DNA特异性损伤的方法，包括纳米孔测序法和单分子计数法。基于特异性核苷酸标记和PCR扩增的纳米孔测序方法可以识别多种病变，但需要热循环和复杂的标记步骤；单分子计数方法可以灵敏地检测DNA损伤，但需要多步骤核苷酸标记、分离和洗涤步骤。

技术实现思路

[0006]基于上述技术背景，维持DNA的完整性和稳定性对所有生物体都至关重要，内源性/外源性因素引起的DNA损伤可引起多种疾病。全基因组DNA损伤水平可能成为临床早期诊断、风险评估和治疗监测的重要生物标志物。然而，由于基因组DNA的多样性，很难实现对基因组DNA损伤的无标记、均相检测。
[0007]为了克服上述技术难点，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术主要的技术贡献在于提供了一种基于碱基切除修复(BER)途径和末端转移酶(TdT)启动的无模板等温循环扩增的无标记和均相生物发光法检测方法，该检测方法可以检测基因组DNA中的单碱基损伤和聚集损伤。
[0009]本专利技术提供的方法中，首先封闭待测基因组中所有的3'
‑
OH末端，通过DNA糖基化酶识别并且切割待测DNA受损部分暴露新的3'
‑
OH末端，在新的3'
‑
OH末端构建富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的杂交链，通过核酸外切酶对所述富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的杂交链中的腺嘌呤单链进行剪切产生单碱基形式的腺嘌呤核苷酸从而产生腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)分子，在萤火虫荧光素酶和荧光素的协助下，通过AMP
‑
ATP
‑
AMP的转化，实现生物发光。
[0010]上述技术方案中Lambda核酸外切酶对富A探针的剪切作用，一方面实现了生物发光，另一方面对DNA损伤信号进行了一次放大。经验证，该方法具有很好的选择性，能特异性地检测单碱基的DNA损伤和聚集的DNA损伤，其聚集DNA损伤的检测限为8.26
×
10
‑
10
mol/L。
[0011]为了进一步提高检测的灵敏度，本专利技术还设计引入核酸内切酶(APE1)诱导的循环裂解信号再一次的放大。所述核酸内切酶(APE1)诱导的循环裂解的检测方法中，本专利技术设计了一种具有两个AP位点的AP探针，该探针能被APE1切割并产生更多的3'
‑
OH引物。AP探针的引入可以产生更多的poly
‑
T结构和更多的AMP来产生增强的生物发光信号。改进方法的灵敏度比原方法提高了3个数量级，比非天然核苷类似物标记法(1
×
10
‑
10
mol/L)、高效液相色谱
‑
串联质谱法(1
×
10
‑
10
mol/L)提高了4个数量级，比适体荧光法(3
×
10
‑9mol/L)提高5个数量级。该方法可准确检测HeLa细胞、A549细胞、HEK
‑
293和MRC
‑
5细胞DNA中的尿嘧啶，检出限为0.011ng。
[0012]以尿嘧啶DNA损伤为模型，检测限为3.26
×
10
‑
14
mol/L，并能区分0.001％的DNA损伤。重要的是，它可以进一步应用于细胞样品中DNA损伤水平的检测，检测限为0.011ng，通过选择合适的DNA糖基化酶，有望成为检测各种DNA损伤的通用平台。
[0013]以上一个或多个技术方案的有益效果是：
[0014](1)本专利技术提供的检测方法显著压缩了现有检测工序，这种生物发光传感器实现了对基因组DNA损伤的无标记、均相检测，无需任何分离和洗涤步骤，是DNA损伤检测领域的一大创新。
[0015](2)本专利技术方法不仅可以检测基因组DNA中的单碱基损伤，而且可以检测基因组DNA中的聚集损伤，且这两种损伤检测之间没有干扰。
[0016](3)本专利技术方法不受序列不同的影响，可以检测出基因组中任意序列的损伤。
[0017](4)利用TdT催化聚合反应的高效性和生物发光固有的高灵敏度，该方法能灵敏地检测DNA损伤，检测灵敏度优于以往报道。以尿嘧啶DNA损伤模型为例，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，其特征在于，所述检测方法如下：封闭待测基因组中所有的3'
‑
OH末端，通过DNA糖基化酶识别并且切割待测DNA受损部分暴露新的3'
‑
OH末端，在新的3'
‑
OH末端构建富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的杂交链，加入核酸外切酶对所述杂交链中富含腺嘌呤的单链进行剪切产生腺嘌呤核糖核苷酸分子，催化荧光素实现生物发光，通过检测光信号强度实现受损DNA的检测。2.如权利要求1所述无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，其特征在于，所述封闭3'
‑
OH的方式包括但不限于向待测样品中加入双脱氧的腺苷三磷酸对3'
‑
OH末端进行封闭；优选的，通过末端转移酶催化双脱氧的腺苷三磷酸对3'
‑
OH末端进行标记；进一步的，所述封闭反应还包括向反应后的体系中加入虾碱性磷酸酶用于中和过量的ddATP。3.如权利要求1所述无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，其特征在于，所述富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的杂交链的构建方式如下：通过末端转移酶催化胸腺嘧啶的三磷酸脱氧核苷酸加入受损DNA的3'
‑
OH末端，形成富含胸腺嘧啶的DNA单链，并对应的加入富含腺嘌呤的探针进行杂交构建富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的杂交链；优选的，所述富含腺嘌呤的探针5'端具有磷酸基团修饰。4.如权利要求1所述无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，其特征在于，所述核酸外切酶为Lambda核酸外切酶。5.如权利要求1
‑
4任一项所述无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，其特征在于，所述检测方法如下：通过TdT催化ddATP封闭基因组DNA中所有的3'
‑
OH，加入rSAP终止反应；DNA糖基化酶切割受损的碱基产生新的3'
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OH末端；随后，TdT催化dTTPs重复加入受损DNA的3'
‑
OH末端，产生丰富的poly
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T结构单链，加入富A的信号探针杂交形成杂交链；所述杂交链在Lambda核酸外切酶水解下产生大量的AMP分子，通过萤火虫荧光素酶和荧光素的协助实现AMP
‑
ATP
‑
AMP的转化，产生生物发光。6.如权利要求1所述无标记、均相生物发光的DNA损伤检测方法，其特征在于，所述检测方法通过核酸内切酶诱导的循环裂解对检测信号进行放大，所述检测方法如下：封闭待测基因组中的3'
‑
OH末端，加入糖基化酶剪切受损碱基并产生新的3'
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OH，在新的3'
‑
OH末端扩展富含T碱基的单链，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琛琛，罗细亮，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：