短小芽孢杆菌LYMC-3的新用途制造技术

本申请公开了短小芽孢杆菌LYMC

【技术实现步骤摘要】
短小芽孢杆菌LYMC
‑
3的新用途


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC
‑
3的新应用。

技术介绍

[0002]近年来，由于人们过度追求经济效益，在农林业病害的防治上，大量使用化学农药，虽然能够减轻一些植物病害的发生，但给自身及生态环境带来了许多负面影响，如环境污染加剧，土壤及作物农药残留严重，病菌抗药性的产生加快，严重威胁着人们的生命财产安全。解决这些问题已经十分迫切，生物防治技术因其与环境兼容性好而越来越受到人们的青睐。在研究开发的各种生防微生物中，使用生防细菌来防治植物病害成为国内外学者研究生物防治的热点。
[0003]短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是常见的生防微生物，具有生物防治，生物降解以及促进植物生长等多种功能。短小芽孢杆菌可以防治多种植物病害，如对稻瘟病、鹰嘴豆根腐病、黄瓜枯萎病及棉花黄萎病等都具有显著的防治效果。因此在农业生产中，利用生物菌芽孢杆菌的生物菌剂代替化学农药和杀菌剂的作用有非常广阔的前景，既能对植物病虫害的发生起抑制作用，很大程度上又维持了生态系统的稳定，还对人类健康和环境副作用小。
[0004]本申请所用菌株是李亮亮博士从洛阳马尾松茎部分离筛选出的具有杀线活性的高效拮抗细菌——LYMC
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3菌株，并对该菌株的形态进行了观察，同时研究其一系列生理生化指标，利用Biolog技术和16S rDNA序列技术分析，最终确定菌株LYMC
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3为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。短小芽孢杆菌LYMC
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3具有内生性，能在马尾松体内良好地定殖和传导，其无菌发酵滤液具有很强的杀线作用，分别以无菌发酵滤液原液及其2倍、4倍、10倍稀释液处理等量松材线虫24h，其线虫死亡率达100％，且死亡的虫体全部消解，因此LYMC
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3菌株未来可能会发展成为一种防治松材线虫病的生物制剂，为人们保护森林提供了一条切实可行的道路。但是要想使它大规模投入到人类的社会生产实践当中，对于它的研究应该更加广泛和深入。而对于LYMC
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3菌株用来防治其他植物病害的相关研究，未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC
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3的新应用，满足在防治茶树轮斑病中的使用需求。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]短小芽孢杆菌LYMC
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3在防治茶树轮斑病中的应用。
[0008]短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液在防治茶树轮斑病中的应用。
[0009]一种制备所述的短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵滤液的方法，将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC
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3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/m冷冻
离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。
[0010]短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的非蛋白提取物在防治茶树轮斑病中的应用。
[0011]所述的短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的非蛋白提取物的制备方法：向除菌发酵滤液中注入2
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3倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌搅拌，使大分子蛋白质、多糖及核酸类物质充分沉淀，于2℃，5000r/min冷冻离心15min，收集非蛋白部分，于40℃，120r/min下旋转蒸发，直至将乙醇完全去除，加去离子水恢复至原体积。
[0012]短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的甲醇粗提物在防治茶树轮斑病中的应用。
[0013]所述的短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的甲醇粗提物的制备方法：取发酵滤液，在50℃下用旋转蒸发仪将其蒸发至干燥，分3次加入适量甲醇缓慢振荡，使干燥物与甲醇充分混匀，离心后获得粗提液；将粗提液在40℃下旋转蒸发至干燥，用去离子水恢复至原体积即得到抑菌粗提物。
[0014]短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的有机溶剂提取物在防治茶树轮斑病中的应用。
[0015]所述的短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的有机溶剂提取物的制备方法，取LYMC
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3菌株发酵滤液，加入2
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3倍体积的有机溶剂，充分振荡，于2℃冰箱中静置24h，使沉淀析出或分层；使用灭过菌的分液漏斗分离溶剂相和残留沉淀物，然后将萃取液在40℃下旋转蒸发至干燥，沉淀物在通风橱里采用自然挥发的方式清除残留溶剂，用蒸馏水恢复至原体积，获得有机溶剂提取物；其中，有机溶剂选自乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯、正丁醇、四氯化碳。
[0016]有益效果：与现有技术相比，本专利技术的松树内生短小芽孢杆菌LYMC
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3，室内盆栽苗防效试验表明，短小芽孢杆菌LYMC
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3菌株发酵液对茶轮斑病菌引起的茶轮斑病有很好的防治效果，室内的预防效果最高达48.59％。通过对LYMC
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3菌株发酵液中的抑菌物质进行研究，发现抑菌物质是一类小分子、极性较高的非蛋白类物质，具有较好的热稳定性，对酸碱较为敏感，强酸强碱环境下，抑菌活性明显降低；对茶轮斑病菌起抑制作用的物质，正丁醇能将其从发酵液中较好的萃取出来。可见，LYMC
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3菌株及其发酵液和发酵液的提取物均具有很好生防作用。
附图说明
[0017]图1是LYMC
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3菌株对病原真菌的拮抗作用结果图；右图为对照(CK)；
[0018]图2是LYMC
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3菌株对茶轮斑病菌菌丝形态和孢子萌发的抑制作用结果图；A为菌丝形态，B为孢子萌发，CK为对照；
[0019]图3是温室内茶轮斑病发病症状图；A为接种病原菌后发病初期症状；B为接种病原菌后发病后期症状；C为对照；
[0020]图4是LYMC
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3菌株发酵液处理病叶后的病斑直径变化图；
[0021]图5是发酵滤液中蛋白与非蛋白提取物对病原菌的抑制作用结果图；
[0022]图6是发酵滤液中不同提取组分对病原菌的抑制作用结果图；
[0023]图7是温度对LYMC
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3菌株抑菌物质抑菌活性的影响结果图；
[0024]图8是pH值对LYMC
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3菌株抑菌物质抑菌活性的影响结果图；
[0025]图9是抑菌物质在不同有机溶剂中的分配结果图。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0027]本申请所采用的短本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.短小芽孢杆菌LYMC
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3在防治茶树轮斑病中的应用。2.短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液在防治茶树轮斑病中的应用。3.权利要求2所述的短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的制备方法，其特征在于：将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC
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3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/m冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。4.短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的非蛋白提取物在防治茶树轮斑病中的应用。5.权利要求4所述的短小芽孢杆菌LYMC
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3的发酵液的非蛋白提取物的制备方法，其特征在于：向除菌发酵滤液中注入2
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3倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌，使大分子蛋白质、多糖及核酸类物质充分沉淀，于2℃，5000r/min冷冻离心15min，收集非蛋白部分，于40℃，120r/min下旋转蒸发，直至将乙醇完全去除，加去离子水恢复...

【专利技术属性】
技术研发人员：谈家金，袁斌，朱明龙，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：