基于液相芯片技术的7种猪繁殖障碍疾病相关病毒检测用引物探针、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了基于液相芯片技术的7种猪繁殖障碍疾病相关病毒检测用引物探针组、试剂盒及其应用，属于病毒检测技术领域。本发明专利技术提供的引物探针组，包括猪瘟病毒检测引物探针、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒检测引物探针、猪圆环病毒2型检测引物探针、猪圆环病毒3型检测引物探针、猪细小病毒检测引物探针、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测引物探针和猪伪犬病病毒检测引物探针。采用引物探针以及所建方法检测样本，检测结果与单个病毒荧光定量PCR方法检测结果高度一致，具有检测特异性好、检测结果重复性好、检测灵敏度高的特点，可同时对7个猪繁殖障碍疾病相关病毒进行检测，且具有通量高、检测成本低的特点。检测成本低的特点。检测成本低的特点。

【技术实现步骤摘要】
mix 5μl，每种20μmol/L正向引物0.5μl，每种20μmol/L反向引物0.5μl，核酸模板4μl，无RNA酶水补充至总体积20μl。
[0022]优选的，所述多重PCR扩增的反应程序如下：25℃，2min；53℃，10min；95℃2min；95℃10sec，60℃30sec(40个循环)。
[0023]优选的，所述杂交的反应体系为扩增产物1.2μl、无RNA酶水1.8μl和杂交液22μl；
[0024]所述杂交的温度为50℃；
[0025]所述杂交的时间为35min。
[0026]本专利技术提供的基于液相芯片技术的7种猪繁殖障碍疾病相关病毒检测引物探针组，能够同时检测猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪犬病病毒，采用所述引物探针组检测样本，检测结果与单一荧光定量PCR检测结果高度一致，具有检测特异性强、重复性好、灵敏和高通量的特点，可同时对7种猪繁殖障碍疾病相关病毒进行检测。
附图说明
[0027]图1为本专利技术实施例中不同杂交温度的优化结果；
[0028]图2为本专利技术实施例中不同杂交时间优化结果。
具体实施方式
[0029]本专利技术提供了基于液相芯片技术的7种猪繁殖障碍疾病相关病毒检测引物探针组，包括猪瘟病毒(CSFV)检测引物探针、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(USPRRSV)检测引物探针、猪圆环病毒2型(PCV2)检测引物探针、猪圆环病毒3型(PCV3)检测引物探针、猪细小病毒(PPV)检测引物探针、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HPRRSV)检测引物探针和猪伪犬病病毒(PRV)检测引物探针；具体引物探针的核苷酸序列以及修饰情况见表1。
[0030]表1所述引物探针组中引物好探针的序列及修饰信息
[0031][0032][0033]在本专利技术中，所述引物委托生工生物(上海)工程有限公司合成并标记修饰，其中引物的5
′
端均标记生物素。所述探针委托上海透景生命科技有限公司进行合成并标记。
[0034]本专利技术提供了一种基于液相芯片技术检测7种猪繁殖障碍疾病相关病毒的试剂盒，包括所述引物探针组。其中所述引物探针组中的7种探针制备杂交溶液。所述引物探针组中，每种引物独立分装。所述试剂盒还包括多重PCR检测用试剂和报告溶液。所述多重PCR检测用试剂为TaqPath
TM 1
‑
Step Multiplex Master Mix。所述报告溶液为链霉亲和素－藻
红蛋白溶液。
[0035]在本专利技术中，所述试剂盒还包括7种分别含目标基因的重组质粒标准品。所述重组质粒标准品中目标基因的扩增引物的核苷酸序列见表2。
[0036]表2重组质粒标准品的扩增引物信息
[0037][0038][0039]本专利技术对所述重组质粒标准品的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组质粒构建方法即可。构建得到重组质粒标准品后通过鉴定，并利用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算拷贝数。本专利技术利用所述重组质粒标准品不同拷贝浓度下检测的荧光强度来判定所建本研究所建检测方法的敏感性。
[0040]本专利技术提供了一种检测7种猪繁殖障碍疾病相关病毒的方法，包括以下步骤：
[0041]1)提取待检测样本核酸；
[0042]2)以步骤1)中提取的核酸为模板，在所述引物探针组中7对引物的作用下进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0043]3)将步骤2)中所述扩增产物与所述引物探针组中7种探针形成的杂交液进行杂交，得到杂交产物；
[0044]4)将所述杂交产物与报告溶液混合反应，检测不同编号的荧光强度，根据荧光强度的编号判断是否感染有对应种类病毒。
[0045]本专利技术提取待检测样本核酸。本专利技术对提取待检测样本核酸的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的病毒核酸提取方案即可。在本专利技术实施例中，采用病毒核酸提取试剂盒完成。
[0046]提取后，本专利技术以提取的核酸为模板，在所述引物探针组中7对引物的作用下进行多重PCR扩增，得到扩增产物。
[0047]在本专利技术中，所述多重PCR扩增的反应体系优选为4
×
Taqpath
TM 1
‑
step multiplex Master mix 5μl，每种20μmol/L正向引物0.5μl，每种20μmol/L反向引物0.5μl，核酸模板4μl，无RNA酶水补充至总体积20μl。所述多重PCR扩增的反应程序优选如下：25℃，2min；53℃，10min；95℃2min；95℃10sec，60℃30sec(40个循环)。
[0048]得到扩增产物后，本专利技术将所述扩增产物与所述引物探针组中7种探针形成的杂
交液进行杂交，得到杂交产物。
[0049]在本专利技术中，所述杂交的反应体系优选为扩增产物1.2μl、无RNA酶水1.8μl和杂交液22μl。所述杂交的温度优选为50℃。所述杂交的时间优选为35～40min，更优选为35min。
[0050]得到杂交产物后，本专利技术将所述杂交产物与报告溶液混合反应15min，在48℃温育条件下检测不同编号的荧光强度，根据荧光强度的编号判断是否感染有对应种类病毒，实现定性检测。
[0051]下面结合实施例对本专利技术提供的7种猪病毒性繁殖障碍疾病相关病毒联合检测用引物探针组、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0052]本专利技术实施例中涉及的材料与试剂说明
[0053]1.病毒材料样品和病毒株的说明
[0054]猪口蹄疫病毒(foot
‑
and
‑
mouth disease virus,FMDV)灭活疫苗、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)活疫苗、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)灭活疫苗(WH－1株)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗(JXA1－R株)均产自中牧实业股份有限公司；猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)灭活疫苗产自浙江诗华诺倍威生物技术有限公司，以上病毒疫苗经检测均含有相应病毒且浓度较高的核酸。猪流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)减毒株SA14
‑
14
‑
2由本实验室保存。含猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)(GenBank号MZ403746)的阳性样品、含猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)(GenBank号MZ403747)阳性样品、含猪伪狂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于液相芯片技术的7种猪繁殖障碍疾病相关病毒检测用引物探针组，其特征在于，包括猪瘟病毒检测引物探针、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒检测引物探针、猪圆环病毒2型检测引物探针、猪圆环病毒3型检测引物探针、猪细小病毒检测引物探针、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测引物探针和猪伪犬病病毒检测引物探针；所述猪瘟病毒检测引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针；所述美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒检测引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的探针；所述猪圆环病毒2型检测引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的探针；所述猪圆环病毒3型检测引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的探针；所述猪细小病毒检测引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的探针；所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的探针；所述猪伪犬病病毒检测引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的探针。2.根据权利要求1所述7种猪繁殖障碍疾病相关病毒检测用引物探针组，其特征在于，在所述引物探针组中，正向引物和反向引物的5
′
端采用生物素修饰；在所述引物探针组中，探针的5
′
端用荧光微球修饰；不同病毒的探针采用不同编号的荧光微球修饰。3.一种基于液相芯片技术检测7种猪繁殖障碍疾病相关病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述引物探针组。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR检测用试剂和报告溶液。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢荣辉，赵灵燕，徐辉，王雅婷，黄靖，孙冰冰，张红丽，董建斐，刘霞，冯肖肖，张璐，安慧婷，薛银，柴娟，虞一聪，
申请(专利权)人：浙江省动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：