经基因组编辑的鸟类制造技术

本公开提供了用于生成嵌合鸟类细胞和嵌合鸟类的外源多核苷酸盒。所述多核苷酸盒可以用于在雄性鸟类胚胎中产生条件致死表型。在一个实施例中，本公开提供了用于卵内破坏雄性雏鸡胚胎的方法。鸡胚胎的方法。鸡胚胎的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经基因组编辑的鸟类
[0001]序列表声明
[0002]本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用以其整体并入。创建于2020年2月24日的所述ASCII副本命名为P
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585110
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PC_ST25.txt，并且大小为355.8KB。


[0003]本公开涉及DNA编辑剂以及其在制备经DNA编辑的细胞和鸟类中的用途。本公开进一步涉及对经DNA编辑的鸟类的蛋中的雄性胚胎赋予条件致死表型的方法。

技术介绍

[0004]ZW性别决定系统是决定鸟类、某些鱼类和甲壳类、某些昆虫类和某些爬行类的后代的性别的染色体系统。字母Z和W用于将所述系统与XY性别决定系统区分开。在ZW系统中，卵子决定后代的性别。雄性是同配性别(ZZ)，而雌性是异配性别(ZW)。Z染色体更大并且具有更多基因，就像XY系统中的X染色体一样。
[0005]早期性别鉴定和分离是所有禽类商业应用，尤其是食用蛋行业中的重要方面。对于肉鸡和火鸡来说，性别分离允许根据两种性别的不同需求制定更适合的管理和饲养方案。基本上所有商业孵化场都使用鸡群性别分离。商业价值较低的雄性鸡会在孵化场被剔除，而雌性鸡用于生产蛋。
[0006]目前，存在三种可用于确定家禽的性别的方法。日龄雏鸡的性别可以通过肛门/泄殖腔鉴定或羽毛分型方法确定。可替代地，可以使雄性雏鸡和雌性雏鸡一起生长到第二性别特性变得显而易见为止，然后可以基于性别将雏鸡分离。肛门/泄殖腔分型依赖于性别相关的解剖结构的表观。羽毛分型是基于在雄性雏鸡与雌性雏鸡之间有所不同的羽毛特性，例如，底色图案以及翅膀羽毛的快/慢生长速率。第三种方法依赖于天然的第二性别特性的表观，例如，雄性的鸡冠和垂肉变得比雌性雏鸡大。
[0007]对日龄雏鸡的肛门/泄殖腔性别确定困难且昂贵。鉴定鸟类的性别需要有较高技能的人员。虽然更易于执行，但羽毛分型的缺点是受限于鸟类的特定遗传杂交。通过第二性别特性进行的性别分型是最容易执行的方法，但具有以下缺点：需要在孵化之后的第一周使两种性别的鸟类一起生长，这是因为对于孵化场来说，饲养成本和饲养转化率考虑因素可能比肛门/泄殖腔分型的费用更昂贵。
[0008]最重要的是，仅在美国和欧洲，每年通过各种方法有几乎十亿只雄性雏鸡被销毁。这不仅是经济问题，而且日益成为道德问题。
[0009]在商业孵化场领域中，需要高通量的方法来防止雄性雏鸡的产生，优选地甚至在蛋阶段，由此避免与存活的雄性雏鸡相关联的问题。

技术实现思路

[0010]本文提供了一种用于卵内破坏雄性胚胎雏鸡的技术，包含组合物和方法。此类组
合物和方法是有益的，因为其允许如农户等鸟类繁殖领域的技术人员将雄性后代与雌性后代之间的自然1:1比率偏斜，从而有利于更具商业用途的雌性后代。
[0011]在一个实施例中，本文提供了一种DNA编辑剂，所述编辑剂包括多核苷酸盒，所述多核苷酸盒具有式5'
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LHA(左同源臂)
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OIE(光遗传学诱导型元件)
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LIE(致死诱导元件)
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RHA(右同源臂)
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3'或式5'
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LHA
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LIE
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OIE
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RHA
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3'，其中(i)所述LHA包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与鸟类的染色体Z上的第一对应核苷酸序列基本上同源；(ii)所述OIE包括第一启动子，所述第一启动子与第二核苷酸序列功能性地连接，所述第二核苷酸序列对诱导子激活的位点特异性重组酶进行编码；(iii)所述LIE包括第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列对致死促进蛋白进行编码，所述致死促进蛋白与所述诱导子激活的位点特异性重组酶的活性操作性地相关；并且(iv)所述RHA包括第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列与鸟类的染色体Z上的第二对应核苷酸序列基本上同源。
[0012]在某些实施例中，所述LHA和所述RHA中的一个或两个与位于鸟类的染色体Z上的经开放转录的区域中的对应核苷酸序列基本上同源。例如，所述经开放转录的区域可以位于鸟类的染色体Z上的组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1
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Z(HINT1Z)基因座处或下游。
[0013]在某些实施例中，所述诱导子激活的位点特异性重组酶可以是Cre重组酶(Cre)(SEQ ID NO:113)或Mag(SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:65)。在某些实施例中，所述诱导子激活的位点特异性重组酶的表达由诱导子诱导。在某些实施例中，所述诱导子是电磁能。例如，所述诱导子可以是波长为450
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485nm的蓝光。
[0014]在某些实施例中，所述诱导子激活的位点特异性重组酶包括诱导子激活的位点特异性重组酶的非功能性肽片段，所述非功能性肽片段在所述诱导子存在的情况下组合以形成活性诱导子激活的位点特异性重组酶。
[0015]在某些实施例中，所述致死诱导蛋白质可以是毒素、促凋亡蛋白、无翅/整合(Wnt)信号传导通路的抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂、成纤维细胞生长因子(FGF)拮抗剂、野生型胱天蛋白酶3、组成型活性胱天蛋白酶3、头蛋白或上述蛋白质中的任何蛋白质的致死诱导片段。
[0016]在一个实施例中，本文公开的所述DNA编辑剂包括：(i)LHA，所述LHA包括SEQ ID NO:105的序列；(ii)OIE，所述OIE包括SEQ ID NO:100的序列，所述SEQ ID NO:100的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，所述SEQ ID NO:116的序列与SEQ ID NO:101的序列连接，所述SEQ ID NO:101的序列与SEQ ID NO:103的序列连接，所述SEQ ID NO:103的序列与SEQ ID NO:102的序列连接，所述SEQ ID NO:102的序列与SEQ ID NO:104的序列连接，所述SEQ ID NO:104的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，或所述OIE包括SEQ ID NO:100的序列，所述SEQ ID NO:100的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，所述SEQ ID NO:116的序列与SEQ ID NO:102的序列连接，所述SEQ ID NO:102的序列与SEQ ID NO:103的序列连接，所述SEQ ID NO:103的序列与SEQ ID NO:101的序列连接，所述SEQ ID NO:101的序列与SEQ ID NO:104的序列连接，所述SEQ ID NO:104的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，或所述OIE包括SEQ ID NO:100的序列，所述SEQ ID NO:100的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，所述SEQ ID NO:116的序列与SEQ ID NO:107的序列连接，所述SEQ ID NO:107的序列与SEQ ID NO:103的序列连接，所述SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种DNA编辑剂，其包括多核苷酸盒，所述多核苷酸盒具有式5'
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LHA(左同源臂)
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OIE(光遗传学诱导型元件)
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LIE(致死诱导元件)
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RHA(右同源臂)
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3'或式5'
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LHA
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LIE
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OIE
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RHA
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3'，其中(i)所述LHA包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与鸟类的染色体Z上的第一对应核苷酸序列基本上同源；(ii)所述OIE包括第一启动子，所述第一启动子与第二核苷酸序列功能性地连接，所述第二核苷酸序列对诱导子激活的位点特异性重组酶进行编码；(iii)所述LIE包括第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列对致死促进蛋白进行编码，所述致死促进蛋白与所述诱导子激活的位点特异性重组酶的活性操作性地相关；并且(iv)所述RHA包括第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列与鸟类的染色体Z上的第二对应核苷酸序列基本上同源。2.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述第一对应核苷酸序列或所述第二对应核苷酸序列位于染色体Z上的经开放转录的区域中。3.根据权利要求2所述的DNA编辑剂，其中所述经开放转录的区域位于鸟类的染色体Z上的组氨酸三联体核苷酸结合蛋白1
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Z(HINT1Z)基因座处或下游。4.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中(i)所述LHA包括SEQ ID NO:105中所示的核苷酸序列或其片段；(ii)所述RHA包括SEQ ID NO:106中所示的核苷酸序列或其片段；或(iii)(i)和(ii)两者。5.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述第一启动子选自由以下组成的组：pCAGG(SEQ ID NO:100)、pGK(SEQ ID NO:109)、pCMV(SEQ ID NO:110)、phSyn(SEQ ID NO:111)和pEFl
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a(SEQ ID NO:112)。6.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述诱导子激活的位点特异性重组酶包括Cre重组酶或Mag重组酶。7.根据权利要求6所述的DNA编辑剂，其中所述诱导子激活的位点特异性重组酶由包括SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:65的序列的核苷酸序列编码。8.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述诱导子激活的位点特异性重组酶的表达由诱导子诱导。9.根据权利要求8所述的DNA编辑剂，其中所述诱导子是电磁能。10.根据权利要求9所述的DNA编辑剂，其中所述电磁能是波长为380
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740nm的可见光。11.根据权利要求10所述的DNA编辑剂，其中所述可见光是波长为450
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485nm的蓝光。12.根据权利要求8所述的DNA编辑剂，其中所述诱导子激活的位点特异性重组酶包括诱导子激活的位点特异性重组酶的非功能性肽片段，所述非功能性肽片段在所述诱导子存在的情况下组合以形成活性诱导子激活的位点特异性重组酶。13.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述诱导子激活的位点特异性重组酶是RNA引导的DNA核酸内切酶。14.根据权利要求13所述的DNA编辑剂，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶是CRISPR相关蛋白(CAS)核酸内切酶。15.根据权利要求13所述的DNA编辑剂，其中所述多核苷酸盒进一步包括第五核苷酸序
列，所述第五核苷酸序列对靶向所述鸟类的必需基因的向导RNA进行编码，所述第五核苷酸序列与所述诱导子激活的位点特异性重组酶的活性操作性地相关。16.根据权利要求15所述的DNA编辑剂，其中所述必需基因选自由以下组成的组：骨形态发生蛋白受体IA型(BMPR1A)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)。17.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述致死促进蛋白选自由以下组成的组：毒素、促凋亡蛋白、Wnt信号传导通路的抑制剂、BMP拮抗剂、FGF拮抗剂、野生型胱天蛋白酶3、组成型活性胱天蛋白酶3、头蛋白以及其致死诱导片段。18.根据权利要求17所述的DNA编辑剂，其中所述致死诱导蛋白具有SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:99的氨基酸序列。19.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中所述鸟类选自由以下组成的组：鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡和鸵鸟。20.根据权利要求1所述的DNA编辑剂，其中(i)所述LHA包括SEQ ID NO:105的序列，(ii)所述OIE包括SEQ ID NO:100的序列，所述SEQ ID NO:100的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，所述SEQ ID NO:116的序列与SEQ ID NO:101的序列连接，所述SEQ ID NO:101的序列与SEQ ID NO:103的序列连接，所述SEQ ID NO:103的序列与SEQ ID NO:102的序列连接，所述SEQ ID NO:102的序列与SEQ ID NO:104的序列连接，所述SEQ ID NO:104的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，或所述OIE包括SEQ ID NO:100的序列，所述SEQ ID NO:100的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，所述SEQ ID NO:116的序列与SEQ ID NO:107的序列连接，所述SEQ ID NO:107的序列与SEQ ID NO:103的序列连接，所述SEQ ID NO:103的序列与SEQ ID NO:108的序列连接，所述SEQ ID NO:108的序列与SEQ ID NO:104的序列连接，所述SEQ ID NO:104的序列与SEQ ID NO:116的序列连接，(iii)所述LIE包括SEQ ID NO:92、或SEQ ID NO:94、或SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:98的序列，并且(iv)所述RHA包括SEQ ID NO:106的序列。21.一种鸟类细胞群体，其中所述鸟类细胞包括根据权利要求1所述的DNA编辑剂。22.根据权利要求21所述的群体，其中所述细胞是原始生殖细...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：以色列农业和农村发展部农业研究组织范卡尼中心，
类型：发明
国别省市：