一种大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法技术

本发明专利技术提供一种大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法，包括步骤：致敏：分别于第0天、第7天和第14天对BALB/c小鼠颈后两前臂间皮下注射大籽蒿花粉致敏液；激发：雾化吸入1μg/μl的大籽蒿花粉蛋白浸液，连续7天，每天30min。本模型在建立过程中，通过对小鼠皮下注射大籽蒿花粉变应原致敏，雾化吸入大籽蒿花粉变应原激发，成功构建了大籽蒿花粉致敏的小鼠哮喘模型，模型小鼠可以很好的模拟人类大籽蒿花粉致敏引起的哮喘的典型特征。这个模型为研究人类大籽蒿花粉过敏性哮喘的发生机制及探索新的治疗方法提供良好的平台。治疗方法提供良好的平台。

【技术实现步骤摘要】
一种大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及一种动物模型的构建方法，特别是籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法。

技术介绍

[0002]呼吸系统过敏性疾病在发达国家和发展中国家都属于严重的健康问题。在过去的40年，过敏性疾病的发生有很大的增长，而呼吸系统过敏性疾病又是儿童、青壮年中最常见的慢性疾病。哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，同气道高反应性和气流受阻相关。哮喘的特征有：可逆的气道阻塞，喘息，慢性的气道炎症、免疫细胞(抗原递呈细胞、Th2类T细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞)的浸润和激活，Th2类细胞因子的浓度增加等。过敏性哮喘是由吸入变应原引起的复杂的多因素作用的疾病，多种遗传因素、生物介质、环境因素等共同参与了疾病的发生发展过程。据世界卫生组织(WHO)统计，哮喘影响全球近3亿人口，给患者带来巨大的痛苦。很少有这样一种病以这样高的发病率发生在各个国家，波及到各个层次包括不同年龄或不同经济状况的人群中，缺乏理想的治疗手段。几十年来肾上腺糖皮质激素仍然是比较有效的治疗和预防过敏性哮喘发作的药物，但其较大的副作用同时也限制了临床的应用。因此深入研究哮喘的发生发展过程，发现有效的预防和治疗的方法及其药物成为当今要迫切解决的问题。
[0003]哮喘病因、发病机制复杂，鉴于人体实验的局限性，目前对哮喘病因、发病机制及治疗的研究主要通过动物模型来进行。与其他疑难病相比，过敏性哮喘的病因和发病机制相对清楚，即外部抗原进入机体后引起的I型变态反应。因此，根据外来抗原进入机体导致I型变态反应这个基本原理而制备的动物模型可能更贴近人类的过敏性哮喘，也就更有可能去认识该病的发病机制。现广泛应用于哮喘治疗的白三烯拮抗剂，其最初的作用机制是通过过敏性哮喘豚鼠模型得以证明的。
[0004]随着转基因及基因敲除技术的广泛应用、细胞介质表型及功能分析试剂的完善，目前大多数采用小鼠建立哮喘模型。小鼠模型对过敏性炎症进程及免疫反应机制的研究具有重要作用。可进行特定细胞或细胞因子的功能评价、及气道炎症及结构改变的动态进程研究。
[0005]目前最常用的小鼠哮喘模型是鸡卵白蛋白(OVA)致敏的模型，也是最成熟的哮喘模型。但OVA并不是引起人类哮喘的自然过敏原，这降低了此模型应用于临床研究的价值。因此，越来越多的研究关注直接引起人类哮喘的常见气传过敏原。
[0006]在中国北方地区，蒿属花粉导致的花粉症是其中发生率最高，最严重的的一种类型。中国有187种蒿属花粉。而大籽蒿花粉又是我国蒿属花粉中常见且致敏性较强的一种。大籽蒿是菊科蒿属，一、二或多年生草本植物。其特点是可产生大量细小的花粉颗粒，可以通过大型气团被运送到数百或甚至数千公里远的地方。为中国北方地区夏秋季最重要的致敏花粉。针对蒿属花粉过敏原进行有效的防治，显得尤为重要。但目前以蒿属花粉过敏性哮喘动物模型为基础的研究还未见到。
[0007]作为最常用的免疫研究工具，小鼠哮喘模型可模拟人类哮喘的速发相及迟发相反应、变态反应性炎症以及气道重塑特征，并在哮喘发病机制的相关分子研究中发挥着重要作用。目前小鼠哮喘模型已广泛应用在变应性哮喘、感染性哮喘、运动性哮喘、压力性哮喘、心理应激哮喘以及职业性哮喘等研究方面。根据不同类型研究的需要，模型制作方法不尽相同。在小鼠哮喘模型的制作过程中，小鼠品系、致敏及激发方法多种多样。致敏是指将变应原采用某种方式导入体内，诱导机体的免疫系统识别抗原发生免疫反应，使B细胞产生针对变应原的特异性抗体，特别是IgE抗体，IgE抗体结合在肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的受体上，使细胞处于致敏状态。致敏方法能够影响宿主小鼠的免疫反应，因此需要综合考虑致敏方式、致敏剂量以及佐剂的类型。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是构建一个可以更好的模拟人类哮喘典型特点的大籽蒿花粉的动物模型。
[0009]本专利技术采用的技术方案是：
[0010]一种大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法，包括步骤：
[0011](1)致敏：分别于第0天、第7天和第14天对BALB/c小鼠颈后两前臂间皮下注射大籽蒿花粉致敏液；
[0012](2)激发：雾化吸入1μg/μl的大籽蒿花粉蛋白浸液，连续7天，每天30min。
[0013]如上所述的构建方法，优选地，步骤(1)中，小鼠皮下注射前，对小鼠的麻醉采用吸入异氟烷麻醉的方式。
[0014]如上所述的构建方法，优选地，步骤(1)中，所述大籽蒿花粉致敏液的配制：取100μl用PBS溶解配置的浓度为0.25μg/μl的大籽蒿花粉蛋白与100μl的氢氧化铝佐剂混合。
[0015]如上所述的构建方法，优选地，步骤(2)中，雾化激发时用的1μg/μl的大籽蒿花粉蛋白液，是用PBS溶解冻干的大籽蒿花粉蛋白制备，比例为：1000ml PBS溶解1g大籽蒿花粉蛋白。
[0016]优选地，所述大籽蒿花粉蛋白的制备方法为将大籽蒿花粉在4℃下，丙酮搅拌6～10小时脱脂后，用0.125M碳酸氢铵搅拌20～40小时提取蛋白；过滤，去离子水透析70～80小时，分装，冻干。
[0017]优选地，所述大籽蒿花粉与丙酮的添加量为5～20g：100～4000ml；透析用的透析袋为3.5kd。
[0018]使用前用phosphate buffered solution(PBS)溶解。
[0019]雾化后的小鼠出现毛发竖起，出现鼻面部骚痒、躁动、腹式呼吸明显的症状；气道反应性升高，肺泡灌洗液(BALF)中以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润；血清中大籽蒿花粉特异性IgE(sIgE)升高，小鼠肺部气管和血管周都有很多炎症细胞浸润，有严重的气道壁水肿、增厚，气道破坏；小鼠肺部炎症细胞浸润及杯状细胞增生数均高于正常对照组，说明哮喘模型构建成功。
[0020]本模型在建立过程中，通过对小鼠皮下注射大籽蒿花粉变应原致敏，雾化吸入大籽蒿花粉变应原激发，成功构建了大籽蒿花粉致敏的小鼠哮喘模型，模型小鼠可以很好的模拟人类大籽蒿花粉致敏引起的哮喘的典型特征。这个模型为研究人类大籽蒿花粉过敏性
哮喘的发生机制及探索新的治疗方法提供良好的平台。
附图说明
[0021]图1为小鼠气道反应性检测结果。
[0022]图2为哮喘模型组和正常对照组小鼠血清大籽蒿花粉特异性IgE。
[0023]图3为哮喘模型组和正常对照组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞分类计数。
[0024]图4为哮喘模型组和正常对照组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子表达。
[0025]图5为哮喘模型组和正常对照组小鼠肺组织AB-PAS染色和HE染色。其中，AB-PAS染色：A1为正常对照组、A2为哮喘模型组；
[0026]HE染色：B1为正常对照组、B2为哮喘模型组。
[0027]图1-图3中**代表哮喘模型组VS.正常对照组，P＜0.01。
具体实施方式
[0028]以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法，其特征在于，包括步骤：(1)致敏：分别于第0天、第7天和第14天对BALB/c小鼠颈后两前臂间皮下注射大籽蒿花粉致敏液；(2)激发：雾化吸入0.1％大籽蒿花粉总蛋白，连续7天，每天30min。2.根据权利要求1所述的大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，小鼠皮下注射前，对小鼠的麻醉采用吸入异氟烷麻醉的方式。3.根据权利要求1所述的大籽蒿花粉致敏的动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大籽蒿花粉致敏液的配制：取100μl用PBS溶解配置的浓度为0.25μg/μl的的大籽蒿花粉蛋白与100μl的氢氧化铝佐剂混...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹佳，张倩，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：