一次性检测多基因的五色FISH探针系统及方法技术方案

本发明专利技术公开了一次性检测多基因的五色FISH探针系统及方法。本发明专利技术的探针系统设计巧妙，实现了在一张标本切片上单次FISH同时检测非小细胞肺癌的ALK、ROSl、RET、MET四个基因的状态，从而快速确定晚期NSCLC患者是否存在上述融合基因，节省了标本和试剂，大大缩短了检测的时间。本发明专利技术对ALK、ROSl、RET和MET四个基因的联合检测，提高了预后预测的灵敏度和准确性。根据本发明专利技术检测结果选择相对应的分子靶向药物，能够更可靠地指导肺癌临床治疗方案的制定，从而改善预后。从而改善预后。

【技术实现步骤摘要】
一次性检测多基因的五色FISH探针系统及方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一次性检测多基因的五色FISH探针系统及方法。

技术介绍

[0002]肺癌高居我国恶性肿瘤病死率的首位，肺癌从组织病理学上可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non
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small cell lung cancer,NSCLC)两大类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85％。在我国肺癌患者5年的生存率仅为13％。NSCLC尤其是肺腺癌如果未能行高灵敏度的基因变异检测，将丧失精准靶向治疗的机会，严重影响患者的生存期以及生活质量。
[0003]目前，化疗和放疗仍然是NSCLC治疗的主要手段之一。在过去的几十年里，虽然科学家们不断地探索NSCLC化疗方案和放疗技术，但取得的成果仍不能令人满意，疗效未能明显提高，且会出现一些比较严重的不良反应，如恶心、呕吐等胃肠道反应，骨髓抑制以及放射性肺炎等，影响患者的生活质量，甚至导致治疗的中断。传统的细胞毒性化学药物可比作是“杀敌一千，自损八百”，因而许多患者对此是谈之色变。
[0004]近年来，随着分子生物学技术的发展，肺癌特异性分子靶向治疗已经成为新的重要治疗方式之一。所谓靶向治疗，是指在精准分子诊断的基础上，利用肺癌细胞和正常细胞之间存在的差异，通过基因或分子的选择，有针对性地抑制恶性肿瘤细胞生长和增殖，达到治疗目的，同时又几乎不影响正常细胞。由于分子靶向药物特异性作用于肿瘤的特定位点，能够有选择性地杀死肿瘤细胞，副作用小，极大地改善了NSCLC患者的生存和预后。
[0005]研究表明，约50％NSCLC的发生是由于一系列的驱动基因所致。目前研究较为成熟且应用于临床的主要有两个作用点，一个是血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)，另一个为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)。随着分子遗传学研究以及分子检测技术的飞速发展，人们慢慢认识到越来越多的新的NSCLC相关驱动基因，包括：热点基因间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、ROS1、间质表皮转化因子(cellular
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mesenchymal to epithelial transition factor，c
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MET)和RET等。
[0006]ALK基因最初是在间变性T细胞淋巴瘤和炎性成纤维细胞瘤中被发现。2007年，EMLA
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ALK融合基因首次被发现存在于部分NSCLC中，并被证实是NSCLC发生发展过程中独立而又关键的分子靶点，在NSCLC中的发生率约为5％。EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和P23带，相隔约12Mb。EML4基因位于2p21区(chr2:42,308,141
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42,471,339)，基因长度为163kb。ALK基因位于2p23区(chr2:29,327,291
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30,056,128)，基因长度为728kb。这两个基因片段的倒位融合，即inv(2)(p21p23)能够使得组织表达新的EML4
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ALK融合蛋白。融合后的EML4启动子位于ALK酪氨酸激酶的上游，从而使融合基因活化，表达EML4
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ALK融合蛋白。通过EML4胞外结构形成的二聚体使ALK受体持续磷酸化，进而持续激活下游的细胞信号通路。
[0007]ROS1是一种跨膜的受体酪氨酸激酶基因，ROS1融合首先发现于恶性胶质瘤中，其融合突变发生于6号染色体q22区。ROS1融合包含一个完整的酪氨酸激酶区域，其融合突变会导致细胞下游信号通路的激活，从而影响细胞的生长、增殖和分化。研究显示，ROS1染色体的重排可以激活ROS1激酶活性，约有1
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2％的NSCLC患者携带重组基因。
[0008]MET即原癌基因c
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MET，原癌基因c
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MET被认为是继EGFR基因突变和ALK基因融合之后，NSCLC又一个重要的驱动基因。原癌基因c
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MET位于人类7号染色体长臂(7q31)，编码的MET广泛表达于肺、肝、肾、胎盘、消化道等多种人类上皮组织，属II型酪氨酸激酶受体。MET与其配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)结合，引起受体酪氨酸磷酸化并通过PI3K和AKT、STAT3或者RAS和MAPK激活下游信号通路。在人类实体瘤和血液恶性肿瘤中，包括胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌，这条信号通路是最常发生异常的信号通路之一。
[0009]RET(ret proto
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oncogene)即RET原癌基因，它由6615个腺嘌呤、8233个胞嘧啶、8744个鸟嘌呤、6815个胸腺嘧啶组成。RET原癌基因位于10号常染色体长臂(l0qll.2)，全长60kb，包含21个外显子，编码1100个氨基酸的酪氨酸激酶受体超家族RET蛋白。最近的研究表明：RET原癌基因能与多种基因发生融合，从而逃脱受体结合配体的调控，进行自我磷酸化、自动传导信号，引发肿瘤生成。NSCLC的RET重排的频率为1％左右。
[0010]目前，针对ALK、ROS1、MET和RET重排或扩增，均有成熟的靶向药物可以应用，可改善上述驱动基因NSCLC患者的预后。例如，以Crizotinib(克唑替尼,Pfizer)为代表的药物是针对EML4
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ALK基因融合突变开发的小分子靶向药物，通过抑制ALK酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明Crizotinib对EML4
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ALK融合突变患者的有效率可达60％以上，而对野生型的患者几乎没有疗效。再例如，Vandetanib(凡德他尼)、Pralsetinib和Selpercatinib等靶向药物能抑制RET基因在内的多种受体酪氨酸激酶的活性，杀伤携带RET融合基因的细胞。
[0011]检测ALK、ROS1、RET和MET重排或扩增状态是指导靶向药物用药的前提。因此，通过高灵敏的检测方法检测融合基因，对于提高NSCLC尤其肺腺癌患者的生存率，延长生存期，提高生活质量有着重要意义。
[0012]目前，临床上用于检测基因重排、融合等突变类型的金标准是荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)。FISH是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。利用特定核酸经荧光素标记后作为探针，与靶DNA进行杂交后，再通过荧光显微镜直接以单个细胞为观察对象进行计数，可以在36小时内实现对待测染色体片段的定性、定量和定位分析。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一次性检测多融合基因的五色FISH探针系统，包含：标记第一荧光素的第一探针，其与ALK基因断裂点5
’
端杂交；标记第二荧光素的第二探针，其与ALK基因断裂点3
’
端杂交；标记第三荧光素的第三探针，其与ALK基因断裂点5
’
端和3
’
端杂交；标记第一荧光素的第四探针，其与ROS1基因断裂点5
’
端杂交；标记第二荧光素的第五探针，其与ROS1基因断裂点3
’
端杂交；标记第三荧光素的第六探针，其与RET基因断裂点5
’
端杂交；标记第四荧光素的第七探针，其与RET基因断裂点3
’
端杂交；标记第五荧光素的第八探针，其与RET基因断裂点5
’
端和3
’
端杂交；标记第三荧光素的第九探针，其与MET基因杂交；标记第四荧光素的第十探针，其与7号染色体着丝粒杂交；其中，第一荧光素、第二荧光素、第三荧光素、第四荧光素、第五荧光素为不同颜色的荧光素。2.如权利要求1所述的五色FISH探针系统，其特征在于，第一荧光素为绿色荧光素，第二荧光素为橙色荧光素，第三荧光素为蓝色荧光素，第四荧光素为红色荧光素，第五荧光素为金色荧光素。3.如权利要求1或2所述的五色FISH探针系统，其特征在于，第一探针位于chr2：29,563,514
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29,926,884；第二探针位于chr2：29,135,420
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29,365,842；第三探针位于chr2：28,933,548
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30,336,478；第四探针位于chr6：117,110,256
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117,598,544；第五探针位于chr6：117,658,624
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117,821,562；第六探针位于chr10：43,258,465
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43,526,541；第七探针位于chr10：43,625,984
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44,026,625；第八探针位于chr10：43,090,623
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44,352,264；第九探针位于chr7：116,054,223
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116,568,442；第十探针位于chr7：7p11.1
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q11.1。4.如权利要求1所述的五色FISH探针系统，其特征在于，通过以下方式制得：所述的第一～第九探针通过以下步骤制得：利用携带有检测基因的BAC菌种，获得所述检测基因的克隆后，提取所述检测基因的DNA；根据设计的杂交位点，选定限制性内切酶对所述检测基因的DNA进行两次酶切，得到所述检测基因的小片段DNA探针；再采用缺口平移的方法将选定的荧光素标记连接到所述检测基因的小片段DNA探针上，纯化得到所述检测基因的探针；所述检测基因为ALK、ROS1、RET或MET基因；所述的第十探针通过以下步骤制得：以7号染色体着丝粒位于chr7：7p11.1
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q11.1的序列为模板，采用聚合酶链技术进行PCR扩增反应得到PCR产物；采用缺口平移的方法将选定的荧光素标记连接到所述PCR产物上，纯化后得到第十探针。5.如权利要求4所述的五色FISH探针系统，其特征在于，携带有ALK基因的BAC菌种，编号...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢红阳，张谷，樊滢，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：