一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测柔红霉素代谢标志物SLC28A3和UGT1A6*4两个基因的多态性，所述试剂盒根据SLC28A3和UGT1A6*4两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、SLC28A3测序引物、UGT1A6*4测序引物以及阳性对照。本发明专利技术以血液直扩、快速扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对柔红霉素疗效及不良反应预测相关的基因多态性进行检测，为柔红霉素临床个性化用药给出基因角度的建议。因角度的建议。因角度的建议。

【技术实现步骤摘要】
一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

技术介绍

[0002]蒽环类药物是由微生物产生的具有抗肿瘤活性的化学物质，包括阿霉素(多柔比星)、表阿霉素(表柔比星)、柔红霉素和阿克拉霉素等，广泛用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，包括急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌及软组织肉瘤等，其作用机制是通过嵌入DNA分子，非特异性插入相邻碱基对之间，与核糖
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磷酸骨架结合，导致DNA分子局部解螺旋，并可干扰拓扑异构酶Ⅱ重新连接断裂的DNA双链，从而阻碍DNA复制、转录和RNA合成过程。蒽环类药物在体内主要由肝脏中的代谢酶如羰基还原酶及醛酮还原酶等羟化或还原生成相应的二级醇代谢产物。研究发现多种外排和摄取转运体如P
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糖蛋白(P
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gp)，多药耐药相关蛋白(MRP)，阳离子转运体(OCT)参与蒽环类药物在细胞中的转运，影响药物在体内的分布。蒽环类药物的不良反应主要是心脏毒性、骨髓抑制和胃肠道反应等，其中心脏毒性是蒽环类药物最严重的不良反应，其产生机制目前尚不十分明确。蒽环类药物的慢性和迟发性心脏毒性与其累积剂量成正相关，药物剂量越大，心脏受损程度越严重。在临床应用中发现蒽环类药物心脏毒性(ACT)存在较大的个体差异，低剂量的蒽环类药物也可能引起心脏毒性，有一些接受低剂量阿霉素治疗的患者在长期随访中发现有心功能异常，还有的患者在使用蒽环类药物尚未达到最大累积剂量就已可观察到心脏损害。蒽环类药物在体内由多种代谢酶代谢，同时其在细胞中的外排和摄取也受到多种转运体的影响，编码这些代谢酶和转运体的基因存在多态性。代谢酶和转运体基因多态性会影响蒽环类药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄，从而影响到蒽环类药物在体内药动学和药效学以及不良反应的差异。
[0003]葡萄糖醛酸转移酶1A6，UGT是体内进行二相代谢最重要的酶之一，可催化葡萄糖醛酸和内源性或外源性化学物质进行葡萄糖醛酸结合反应。UGT主要存在于肝细胞的内质网膜和核膜上，其他组织如肾和肠等也有不同程度的分布。葡萄糖醛酸化是体内一个重要的解毒途径，影响很多药物、毒物的分解、代谢和排出。尽管多柔比星和柔红霉素母药不发生葡萄糖醛酸化反应，但是其代谢物可通过UGT代谢生成葡萄糖醛酸化产物。因此UGT基因突变会改变其葡萄糖醛酸化水平，从而导致毒性蒽环类代谢物的蓄积。
[0004]SLC28A3(hCNT3)表达于全身各组织，包括心脏。SLC28A3可选择性地转运嘧啶和嘌呤以及一些抗癌药物，如吉西他滨和氟达他滨等。近年来研究发现SLC28A3也可将一些蒽环类药物(如多柔比星和柔红霉素)转运至细胞内。SLC28A3突变可降低SCL28A3mRNA的表达。现有的关于代谢酶和转运体基因多态性对ACT的影响的研究中，已得出明确结论且证据级别相对较高的文献显示UGT1A6突变的患者具有较高的ACT风险，而SLC28A38突变的患者具有较低的ACT风险，因此推荐儿童癌症患者接受多柔比星或柔红霉素治疗前对SLC28A3和
UGT1A6基因位点进行检测。
[0005]目前，对于基因多态性检测的方法主要有直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、Taqman荧光探针法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高或试验成本高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉的检测基因多态性的方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
[0008]本专利技术的试剂盒针对SLC28A3(C1381T)、UGT1A6*4(G>T)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、SLC28A3(C1381T)测序引物、UGT1A6*4(G>T)测序引物、阳性对照。
[0009]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0010][0011][0012]优选的，所述SLC28A3(C1381T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述UGT1A6*4(G>T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。
[0013]优选的，所述的SLC28A3(C1381T)测序引物、UGT1A6*4(G>T)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
[0014]更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定
[0015]优选的，SLC28A3(C1381T)测序引物对应的测序区域为SLC28A3(C1381T)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；UGT1A6*4(G>T)测序引物对应的测序区域为UGT1A6*4(G>T)
待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。
[0016]优选的，SLC28A3(C1381T)和UGT1A6*4(G>T)共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:9所示。
[0017]优选的，所述的扩增反应液，包括，SLC28A3(C1381T)和UGT1A6*4(G>T)特异性扩增引物，还包括血液样品PCR预混液(2
×
)、海藻糖。
[0018]更优选的，反应液各组分浓度分别为SLC28A3(C1381T)前引物(0.2uM)，SLC28A3(C1381T)后引物(0.2uM)，UGT1A6*4(G>T)前引物(0.25uM)，UGT1A6*4(G>T)后引物(0.25uM)，PCR预混液(1
×
)，海藻糖(0.2％)；
[0019]优选的，所述的PCR预混液为Blood Direct PCR Master Mix(2X)，含有耐血的HemoTaq
TM
DNA聚合酶，对全血中血红素等各种PCR抑制剂表现出超强的抗性。
[0020]优选的，为获得最高的检测灵敏度，20μl的PCR扩增体系中最大加入的血液量可以达到4μl，即20％体积。
[0021]优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的SLC28A3
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1381C/T型、UGT1A6*1/*4型基因组DNA，对未知本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测柔红霉素代谢标志物SLC28A3和UGT1A6*4两个基因的多态性，所述试剂盒针对SLC28A3和UGT1A6*4两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、SLC28A3测序引物、UGT1A6*4测序引物以及阳性对照。2.根据权利要求1所述的用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述SLC28A3的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述UGT1A6*4的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。3.根据权利要求1所述的用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述SLC28A3测序引物、UGT1A6*4测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。4.根据权利要求1所述的用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，SLC28A3和UGT1A6*4共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:9所示。5.根据权利要求1所述的用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括SLC28A3和UGT1A6*4特异性扩增引物、血液样品PCR预混液和海藻糖。6.根据权利要求1所述的用于柔红霉素代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括浓度为20ng/ul的SLC28A...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，孙悦，陈立波，
申请(专利权)人：菲思特上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：