利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法技术

本发明专利技术提供了利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法，具体提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸，所述核酸检测器不与所述gRNA杂交；所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；所述CRISPR效应蛋白选自Mad7或LbCas12a。LbCas12a。

【技术实现步骤摘要】
利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，涉及利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法，具体涉及利用Cas蛋白进行核酸检测的方法，所述检测方法中的检测器为双链核酸检测器。

技术介绍

[0002]特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。
[0003]目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。
[0004]2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。申请人基于Cas12i和Cas12j也开发了相应的核酸检测体系，例如，中国专利申请(CN111996236A，公开日：2020年11月27日)公开了基于Cas12i和Cas12j的核酸检测方法，但是，上述方法中所利用的检测器均是单链核酸；本申请对上述检测方法中的检测器进行了改进，提出了一种利用双链核酸作为检测器进行核酸检测的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行核酸检测的方法、组合物、系统和试剂盒，尤其提供了一种利用优化的核酸检测器进行靶核酸检测的方法、组合物、系统和试剂盒。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸，所述核酸检测器不与所述gRNA杂交；
[0007]所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；所述CRISPR效应蛋白选自Mad7或LbCas12a。
[0008]所述Mad7记载在专利申请(CN111511906A，公开日期：20200807中)，在其他的实施方式中，所述Mad7还可以包括Mad7的突变体或直向同源物，例如，US10704033B1中记载的Mad7的直向同源物Mad7v1、Mad7v2、Mad7v3和Mad7v4，以及US10604746B1中记载的MAD7的突
变体MAD70系列蛋白(US10604746B1的SEQ ID No.8、9、10或15所示)。
[0009]本专利技术中，所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；在一个实施方式中，所述核酸检测器为单链核酸，所述单链核酸具有反向重复序列，所述反向重组序列可以通过碱基互补配对形成双链互补配对结构；在其他的实施方式中，所述互补配对结构由双链核酸互补配对形成；在一个实施方式中，所述核酸检测器的核酸为双链核酸。所述单链核酸或双链核酸的核酸为DNA或RNA。
[0010]另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物，所述系统或组合物包括上述CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器。
[0012]另一方面，本专利技术还提供了上述系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。
[0013]另一方面，本专利技术还提供了上述系统或组合物在制备检测样品中靶核酸的试剂或试剂盒中的应用。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了一种切割非靶核酸的方法，所述方法包括，使核酸群体与CRISPR效应蛋白和gRNA接触，所述核酸群体包含靶核酸和多个非靶核酸，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；所述CRISPR效应蛋白切割所述非靶核酸，所述非靶核酸包括可以形成双链互补配对结构的核酸，所述非靶核酸不与所述gRNA杂交；所述CRISPR效应蛋白选自Mad7或LbCas12a。
[0015]所述接触可以是在体外、离体或体内的细胞内部。
[0016]优选的，所述切割非靶核酸为非特异性的切割所述非靶核酸。
[0017]所述非靶核酸包括可以形成双链互补配对结构的核酸；在一个实施方式中，所述非靶核酸为单链核酸，所述单链核酸具有反向重复序列，所述反向重组序列可以通过碱基互补配对形成双链互补配对结构；在其他的实施方式中，所述互补配对结构由双链核酸互补配对形成；在一个实施方式中，所述非靶核酸为双链核酸。
[0018]另一方面，本专利技术还提供了上述CRISPR效应蛋白和gRNA在非特异性的切割所述非靶核酸中的应用，或在制备用于非特异性的切割所述非靶核酸的试剂或试剂盒中的用途。
[0019]上述利用Mad7或LbCas12a切割非靶核酸的方法，在实际应用时，可以用来清除不想要的非目标核酸或者污染的核酸，例如，核酸扩增时的气溶胶污染。
[0020]本专利技术中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。
[0021]本专利技术中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于凝胶电泳检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号检测，电化学检测和基于半导体的检测。
[0022]在一些实施方式中，本专利技术的方法还包括测量CRISPR效应蛋白产生的可检测信号的步骤。所述CRISPR效应蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发trans切割活性，从而切割所述核酸检测器进而产生可检测信号。
[0023]本专利技术中，所述可检测信号可以是当切割核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可
检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化)，基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。
[0024]在优选的实施方式中，所述可检测信号通过以下方式实现：所述核酸检测器的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸，所述核酸检测器不与所述gRNA杂交；所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；所述CRISPR效应蛋白选自Mad7或LbCas12a。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸检测器的核酸为单链核酸，所述单链核酸具有反向重复序列，所述反向重组序列可以通过碱基互补配对形成双链互补配对结构；或者，所述核酸检测器的核酸为双链核酸。3.一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述系统或组合物或试剂盒包括权利要求1
‑
2任一权利要求中的CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器。4.权利要求3所述的系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交；所述核酸检测组合物选自第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物、和第三核酸检测组合物的任意一种、任意两种或三种；所述第一核酸检测组合物包括Cas12i，可以结合Cas12i以及与靶核酸上的第一靶序列杂交的第一gRNA，和第一单链核酸检测器；所述第二核酸检测组合物包括Cas12b，可以结合Cas12b以及与靶核酸上的第二靶序列杂交的第二gRNA，和第二单链核酸检测器；所述第三核酸检测组合物包括Cas12j，可以结合Cas12j以及与靶核酸上的第三靶序列杂交的第三gRNA，和第三单链核酸检测器；所述第一单链核酸检测器的核酸由两个连续的核苷酸组成；所述第二单链核酸检测器的核酸结构为核酸类似物，所述核酸类似物为锁核酸(LNA)；所述第三单链核酸检测器的核酸结构为核酸类似物，所述核酸类似物为2
’
氧甲基RNA。6.一种用于检测样品中靶核酸的试剂或系统或试剂盒，所述试剂或系统或试剂盒包括CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：