一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，包括可口革囊星虫养殖、可口革囊星虫ROS模型建立和模型验证三个步骤，其中可口革囊星虫ROS模型建立包括试验可口革囊星虫挑选、产ROS的淋巴血细胞确定、透明细胞分离方法确定、阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定、ROS体外稳定性和重现性实验六个步骤。通过利用可口革囊星虫模型进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫属于闭管式循环的体腔动物，能较真实的反应机体代谢；可口革囊星虫透明细胞细胞膜薄，荧光标记物及抗氧化剂容易渗透入透明细胞内，可以更好的对抗氧化性结果进行显示；可口革囊星虫容易养殖，成本低，且实验操作简单。且实验操作简单。且实验操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法


[0001]本专利技术属于筛选抗氧化剂
，具体涉及一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法。

技术介绍

[0002]随着生活水平的提高，人们更加关注身体健康的。活性氧是影响生物信号传导的重要物质，其堆积与衰老、心血管疾病等多种慢性疾病的发生相关联。目前许多纯化合物、食品和膳食补充剂的抗氧化活性得到了广泛的研究，新的抗氧化剂(即自由基清除剂)筛选也不断深入。
[0003]目前抗氧化剂筛选评价模型主要有体外评价和体内评价法，其中体外评价主要包括化学评价法、细胞模型评价法，体内评价方法主要有动物评价法。化学评价法无法真实模拟生理环境，未考虑药物跨膜进入细胞等作用，细胞模型评价法未考虑体内新陈代谢作用等因素，因此体外评价方法最大的缺陷是无法真实模拟体内环境，不能真实反映抗氧化物的实际抗氧化效果。体内抗氧化法动物模型大小鼠模型、斑马鱼模型，主要以小鼠为主，此法昂贵且耗时，并不适合食品和膳食补充剂初期筛选。斑马鱼模型因个体小，注射难度大及血液少不能抽取等不足。因此很有必要筛选一种不仅具备体外细胞模型，又具备体内动物模型优点的抗氧化剂筛选评价模型。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，解决了化学评价法无法真实模拟生理环境，未考虑药物跨膜进入细胞等，细胞模型评价法未考虑体内新陈代谢作用等，大小鼠动物模型法昂贵且耗时、操作难等因素。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，包括以下步骤：
[0006]S1：可口革囊星虫养殖：挑取健康、体重在4.0
±
0.5g的可口革囊星虫，放入塑料方盘中饲养，盘中铺5厘米厚的沙质土。
[0007]S2：可口革囊星虫ROS模型建立：
[0008]A1：试验可口革囊星虫挑选：挑选体重在4.0
±
0.5g的可口革囊星虫，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，在显微镜下观察淋巴液血细胞的种类，辨别雌性和雄性可口革囊星虫，并选择雄性可口革囊星虫作为试验动物。
[0009]A2：产ROS的淋巴血细胞确定：挑选发育成熟的星虫个体，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，离心后，用PBS稀释成106cell/mL血细胞悬液，取200uL加入50μLDCFH
‑
DA工作液后，轻轻混匀后避光孵育，避光孵育后，用PBS洗涤两遍后，再紧接着用200uL的PBS轻轻重悬血细胞，在荧光显微镜下观察呈现绿色光的血细胞，以便确定用于测定ROS含量的血细胞。
[0010]A3：透明细胞分离方法确定：用15％和45％的Pereoll液(v/v)各lmL于离心管内，制成梯度，再加5mL血细胞悬液于梯度上，离心一段时间后，观察各层细胞情况，确定透明细
胞所在的层。
[0011]A4：阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定：配置不同梯度浓度的H2O2液，往星虫体腔内注射50uL不同浓度H2O2液，分别在倍数间隔时间后，从每只星虫体内抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，按A2步骤方法测定透明血细胞ROS含量，以不同时间点星虫存活率大于95％，透明细胞ROS含量变化范围小于5％为标准，确定H2O2浓度及作用时间。
[0012]A5：ROS体外稳定性：用200μmol/L的H2O2胁迫星虫，分别在梯度间隔时间后，取星虫体腔液离心收集透明血细胞，稀释到107，放置于一定温度的环境下，分别在不同间隔时间测定透明细胞ROS含量，以ROS含量变化范围小于5％为标准，确定放置时间，即测定ROS含量试验的操作时间。
[0013]A6：重现性实验：为了验证产ROS星虫模型的重现性，用A4步骤确定的方法，往星虫体腔内注射50ul 200μmol/L的H2O2液，并在一定间隔的时间后，抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，测定透明血细胞ROS含量，分别重复多次，计算RSD值，考察方法的重现性。
[0014]S3：模型验证：
[0015]A1：抗氧化剂验证效果：ROS模型可口革囊星虫分成2组试验组和对照组，每组10只，往试验组星虫体内注射200uL 2mg/mL的维生素C，对照组星虫体内注射同量的生理盐水，并在一定间隔的时间后，观察星虫体腔透明血细胞ROS含量。
[0016]A2：ROS清除率计算：ROS清除率(％)＝(对照组ROS含量—试验组ROS含量)/对照组ROS含量
×
100％。
[0017]优选的，所述S1步骤可口革囊星虫养殖中盘中铺设的沙质土中土与沙的比例为3:1，且养殖条件为每天干露12h，淹水12h，养殖海水盐度为25
±
1ppt，温度为25
±
1℃，养殖时投喂硅藻。
[0018]优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A2步骤产ROS的淋巴血细胞确定中透明细胞为产ROS细胞。
[0019]优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A3步骤透明细胞分离方法确定中，用15％和45％的Pereoll液制成梯度，4000rpm/min离心10min。
[0020]优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A4步骤阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定中H2O2液的浓度以50μmol/L向上层梯度增加，其浓度依次为：0、50、100、150、200、250、300、350、400和450μmol/L，并且从每只星虫体内抽取淋巴液时间分别注射H2O2后为3、6、12、24和48h，且以星虫存活率大于95％，透明细胞ROS含量变化范围小于5％为标准，确定H2O2浓度及作用时间。
[0021]优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A5步骤ROS体外稳定性中，注射200μmol/L的H2O2后，分别于3、6、9、12、15和18h后取星虫体腔液离心收集透明血细胞，且在温度为25℃条件下，于0、0.5、1、2、3、4、5和6h后，分别测定透明细胞ROS含量。以ROS含量变化范围小于5％为标准，确定时间。
[0022]优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A6步骤重现性实验中抽取淋巴液测定ROS含量的时间分别为3、6、9、12、15和18h后，并且重现性实验重复的次数至少为5次。
[0023]优选的，所述S3步骤模型试验中A1步骤抗氧化剂验证效果中，以ROS清除率为指标，分别于1h、3h、6h和12h后，测定星虫体腔透明血细胞ROS含量，计算清除率。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0025]1、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫属于星虫动物门，为海生、闭管式循环的体腔动物，属于活体动物细胞，能较真实的反应机体代谢。
[0026]2、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫形态结果较简单，属于较低等动物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：可口革囊星虫养殖：挑取健康、体重在4.0
±
0.5g的可口革囊星虫，放入塑料方盘中饲养，盘中铺5厘米厚的沙质土；S2：可口革囊星虫ROS模型建立：A1：试验可口革囊星虫挑选：挑选体重在4.0
±
0.5g的可口革囊星虫，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，在显微镜下观察淋巴液血细胞的种类，辨别雌性和雄性可口革囊星虫，并选择雄性可口革囊星虫作为试验动物；A2：产ROS的淋巴血细胞确定：挑选发育成熟的星虫个体，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，离心后，用PBS稀释成106细胞/mL血细胞悬液，取200uL加入50μL DCFH
‑
DA工作液后，轻轻混匀后避光孵育，避光孵育后，用PBS洗涤两遍后，再紧接着用200uL的PBS轻轻重悬血细胞，在荧光显微镜下观察呈现绿色光的血细胞，以便确定用于测定ROS含量的血细胞；A3：透明细胞分离方法确定：用15％和45％的Pereoll液(v/v)各lmL于离心管内，制成梯度，再加5ml血细胞悬液于梯度上，4000转/min离心10min，观察各层细胞情况，确定透明细胞所在的层；A4：阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定：配置不同梯度浓度的H2O2液，往星虫体腔内注射50ul不同浓度H2O2液，分别在倍数间隔时间后，从每只星虫体内抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，按A2步骤方法测定透明血细胞ROS含量，以不同时间点星虫存活率大于95％，透明细胞ROS含量变化范围小于5％为标准，确定H2O2浓度及作用时间；A5：ROS体外稳定性：用200μmol/L的H2O2胁迫星虫，分别在梯度间隔时间后，取星虫体腔液离心收集透明血细胞，稀释到107，放置于一定温度的环境下，分别在不同间隔时间测定透明细胞ROS含量，以ROS含量变化范围小于5％为标准，确定放置时间，即测定ROS含量的操作时间；A6：重现性实验：为了验证产ROS星虫模型的重现性，用A4步骤确定的方法，往星虫体腔内注射50uL200μmol/L的H2O2液，并在一定间隔的时间后，抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，测定透明血细胞ROS含量，分别重复多次，计算RSD值，考察方法的重现性；S3：模型验证：A1：抗氧化剂验证效果：ROS模型可口革囊星虫分成2组：试验组和对照组，每组10只，试验组星虫体内注射200uL 2mg/mL维生素C，对照组星虫体内注射同量的生理盐水，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周逢芳，蔡彬新，阮少江，黄伟卿，李筝筝，
申请(专利权)人：宁德师范学院，
类型：发明
国别省市：