膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺制造技术

本发明专利技术涉及肽纯化技术领域，针对现有组氨酸二肽分离纯化效率低的问题，公开了膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括：将组氨酸二肽配成母液备用；将金枪鱼粗提液进行陶瓷膜微滤处理，再对截留液加水进行透析，收集透过液并合并，继续采用高通量改性膜进行分离，物料浓缩；根据不同色谱柱及液体流动相对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；测定金枪鱼加工副产物中各阶段组氨酸二肽含量及回收率；分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。通过分离方法、纯化工艺及检测验证手段优化，来实现组氨酸二肽的有效提取，通过制备高通量改性膜，来提高组氨酸二肽的分离持续性与提取效率，充分去除金枪鱼粗体液中的金属离子。的金属离子。的金属离子。

【技术实现步骤摘要】
膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺


[0001]本专利技术涉及肽纯化
，尤其是涉及膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺。

技术介绍

[0002]组氨酸二肽(Histidine
‑
containing dipetides,HCDPs)是一类天然水溶性二肽，具有许多生理特性，组氨酸二肽在食品、药品、保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用潜力，例如：作为肉类抗氧化剂，能够抑制血红蛋白、脂类氧化酶、铁离子等作用下产生的脂质氧化反应；作为免疫调节剂、抗炎症化及治疗烧伤的药物，能够保护细胞膜，对细胞的动态平衡起重要作用，促进细胞的修护，有利于伤口愈合；作为神经调节剂，具有神经调节的功能；作为抗衰老剂、降血压、治疗癌症、代谢性疾病等良药。
[0003]金枪鱼肉腥味重、肌肉纤维粗大且有不良的柴样口感，同时体内累积大量乳酸使其肉有怪酸味，故常加工成罐头或木鱼精调味料，精深化利用程度不够充分，在其加工生产过程中，会产生大量的加工副产物，比如内脏、暗色肉、鱼皮和鱼骨等，约占重量的50
‑
70％，其不仅具有大量的蛋白质、油脂等，并且含有多种的生物活性物质。舟山及宁波地区金枪鱼年加工量在全国位于前列，其加工副产物多达50吨/天，这些副产物通常被加工成廉价的饲料，利用价值低，造成了大量宝贵营养和功能成分的浪费。金枪鱼等一些洄游鱼类能够持续不断游泳的原因之一是其肌肉中含有较多的含组氨酸的游离二肽，即肌肽(β
‑
丙氨酰
‑
L
‑r/>组氨酸，carnosine)、鹅肌肽(β
‑
丙氨酰
‑1‑
甲基
‑
L
‑
组氨酸，anserine)、鲸肌肽(β
‑
丙氨酰
‑3‑
甲基
‑
L
‑
组氨酸，balenine)，大量研究表明，肌肽和鹅肌肽具有降低尿酸、延缓痛风症状等功效，但是由于其在组织中含量较少，直接取得率不高。
[0004]目前，通过生物、化学方法或者是从天然原料中提取获得组氨酸二肽的成本都较高，限制了组氨酸二肽的应用。尤其是在组氨酸二肽分离过程中，现有的滤膜易受酶解杂质或者肽的堵塞，普遍水通量较低，随着使用时间的延长，水通量衰减严重，过滤效率显著降低；另外，现有肽粗体液中含有较多的有毒金属离子，如：铜、锌、铅等，而金属离子又无法有效除，会留存在肽产物中，对人体造成损伤，因此，开发更高效低成本的组氨酸二肽分离纯化技术对于推动其在食品、药品等领域的广泛应用具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为了克服现有组氨酸二肽分离纯化效率低的问题，提供膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，本专利技术通过分离方法、纯化工艺及检测验证手段优化，来实现组氨酸二肽的有效提取，通过制备高通量改性膜，来提高组氨酸二肽的分离持续性与提取效率，充分去除金枪鱼粗体液中的金属离子。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，包括如下处理步骤：(1)配置母液：将组氨酸二肽配成母液备用；
(2)粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行陶瓷膜微滤处理，再对截留液加水进行透析，收集透过液并合并，继续采用高通量改性膜进行分离，物料浓缩；(3)高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；(4)测定金枪鱼加工副产物中各阶段组氨酸二肽含量及回收率；(5)分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。
[0007]作为优选，步骤(1)中母液的浓度为1
‑
1.2mg/mL；步骤(2)的具体过程为：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.5
‑
0.55μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复4
‑
6次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩。
[0008]作为优选，所述步骤(3)中的高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6
×
250mm，5μm)；流动相甲醇：20
‑
22mM PH7.0
‑
7.2磷酸缓冲液＝5：94
‑
96；流速0.4
‑
0.6mL/min；进样体积10
‑
10.5μL；检测波长：210nm；运行时间：20
‑
25min。
[0009]作为优选，步骤(4)中，各阶段肽指的是粗提液、透过液和截留液的中的肽含量。
[0010]作为优选，所述步骤(5)的具体过程为：采用步骤(3)所述的高效液相色谱技术TSKgel2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.44
‑
0.46μm滤膜，进样量10
‑
10.8μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝40：60
‑
62：0.4
‑
0.6；检测波长220nm流速0.5
‑
0.6mL/min柱温30
‑
31℃。
[0011]本专利技术通过制定最优的粗提液分离、浓缩及纯化工艺，引入完备的检测和评估技术手段，最终得到较高纯度组氨酸二肽的制备工艺。
[0012]作为优选，所述高通量改性膜的制备过程如下：1)将硫酸锆和2，5
‑
二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28
‑
34％的硫酸，超声分散15
‑
20min，然后加热至105
‑
115℃水热反应18
‑
22h，冷却至室温后将产物过滤、清洗、干燥得到配位体基架；2)将配位体基架和1
‑
(3
‑
氨基丙基)咪唑加入乙醇中，氮气保护下搅拌4
‑
6h；再加入3
‑
异硫氰酸溴丙酯，氮气保护下反应16
‑
20h，继续加入六氟磷酸钠，45
‑
50℃搅拌反应8
‑
10h；将产物过滤后用无水乙醇洗净、真空干燥后得到金属离子吸附体改性的配位体基架；3)将咪唑溶于去离子水中，然后加入金属离子吸附体改性的配位体基架，分散均匀后调节溶液pH值至5.5
‑
6，得到A溶液，A溶液中咪唑的质量浓度为1
‑
1.2％；4)将均苯三甲酰氯加入正丁醇中，搅拌溶解后得到均苯三甲酰氯的质量浓度为0.8
‑
1.2％的B溶液；5)将多孔聚醚砜基膜浸入A溶液中浸泡15
‑
18min，取出后将多孔聚醚砜基膜上多余的A溶液吹扫干净；再将多孔聚醚砜基膜浸入B溶液中反应35
‑
40min；取出后将多孔聚醚砜基膜在60<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，包括如下处理步骤：（1）配置母液：将组氨酸二肽配成母液备用；（2）粗提液处理：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行陶瓷膜微滤处理，再对截留液加水进行透析，收集透过液并合并，继续采用高通量改性膜进行分离，物料浓缩；（3）高效液相色谱条件的建立：比较不同色谱柱及液体流动相在不同比例、流速、pH条件下对肽母液的分离效果，得到高效液相色谱；（4）测定金枪鱼加工副产物中各阶段组氨酸二肽含量及回收率；（5）分析金枪鱼加工副产物相的对分子质量及纯度。2.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，步骤（1）中母液的浓度为1
‑
1.2mg/mL；步骤（2）的具体过程为：将金枪鱼加工副产物的粗提液进行0.5
‑
0.55μm陶瓷膜微滤处理，截留液加水进行透析，重复4
‑
6次，收集透过液并合并；依次采用1000Da、200Da高通量改性膜进行分离，反渗透RO膜进行物料浓缩。3.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，所述步骤（3）中的高效液相色谱为：色谱柱CAPCELL PAK C18（4.6
×
250 mm，5μm）；流动相甲醇：20
‑
22mM PH7.0
‑
7.2 磷酸缓冲液=5：94
‑
96；流速0.4
‑
0.6 mL/min；进样体积10
‑
10.5μL；检测波长：210 nm；运行时间：20
‑
25min。4.根据权利要求1或3所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，步骤（4）中，各阶段肽指的是粗提液、透过液和截留液的中的肽含量。5.根据权利要求1所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，所述步骤（5）的具体过程为：采用步骤（3）所述的高效液相色谱技术TSKgel 2500凝胶柱对针式滤膜分离后液体的分子量范围进行分析，针式滤膜的孔径为0.44
‑
0.46μm滤膜，进样量10
‑
10.8μL，流动相：乙腈：水：三氟乙酸=40：60
‑
62：0.4
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0.6；检测波长220nm流速0.5
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0.6 mL/min柱温30
‑
31℃。6.根据权利要求1或2所述的膜处理结合高效液相色谱制备高纯度组氨酸二肽的工艺，其特征在于，所述高通量改性膜的制备过程如下：1）将硫酸锆和2，5
‑
二氨基对苯二甲酸及硫酸溶解在三乙醇胺中，加入质量浓度为28
‑
34%的硫酸，超声分散15
‑
20min，然后加热至105
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【专利技术属性】
技术研发人员：王家星，孙继鹏，姚玮，马明珠，胡诗琦，周宇芳，杨会成，廖妙飞，
申请(专利权)人：浙江省海洋开发研究院，
类型：发明
国别省市：