信号放大量子点荧光免疫探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种信号放大量子点荧光免疫探针的制备方法，包括以下步骤：利用缩合剂将羧基量子点荧光微球活化，加入亲和素、酪蛋白进行反应，形成量子点荧光微球

【技术实现步骤摘要】
应；
[0013](4)向一次反应后的溶液中加入所述量子点荧光微球
‑
亲和素复合物，再加入所述 生物素化抗体进行二次反应，多次循环标记，制得信号放大的量子点荧光免疫探针。
[0014]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤(1)的具体步骤包括：
[0015](101)向量子点溶液中加入缩合剂进行活化，混匀超声分散5—20s，振荡反应10 —30min；
[0016](102)向步骤(101)得到的溶液中加入亲和素，偶联反应0.5—3h；
[0017](103)向步骤(102)得到的溶液中加入封闭液，常温反应0.5—2h；
[0018](104)将步骤(103)离心后的沉淀用保存液复溶，得到量子点
‑
亲和素复合物。
[0019]进一步的，所述缩合剂采用N
‑
羟基琥珀酰亚胺、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲胺丙基)碳二 亚胺、NN
’‑
羰基二咪唑、4
‑
(4，6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉盐酸盐中的一种或 两种以上的混合物。
[0020]进一步的，所述封闭液为pH6—8、含质量分数0.5—2％酪蛋白和0.01—1％吐温20 的5—200mM PBS。
[0021]进一步的，所述保存液为pH 6.5—7.8、含0.5—5％牛血清白蛋白、5—30％海藻糖、 0.5—5％聚乙烯吡咯烷酮K30和0.1—5％吐温20的10—200mM PBS。
[0022]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤(2)的具体步骤为：
[0023]向含活化生物素的缓冲液中加入抗体，生物素和抗体的摩尔质量比是20：1—1：1， 在透析袋中反应6—12h，得到生物素化的抗体。
[0024]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤(3)的具体步骤为：
[0025]将生物素化抗体和量子点荧光微球
‑
亲和素复合物按1:0.1—1:2的比例进行混合， 反应1—8h。
[0026]为解决上述技术问题，本专利技术采用的第二个技术方案是：提供一种如上所述的制备 方法制得的信号放大量子点荧光免疫探针。
[0027]通常的量子点荧光探针制备过程，量子点和抗体之间只标记一次；本专利技术建立在生 物素与亲和素能够高亲和力结合的基础上：将荧光量子点标记亲和素，生物素标记抗体， 第一步就形成了量子点
‑
亲和素
‑
生物素
‑
抗体这种复合结构，第二步先后加入量子点
‑
亲 和素和生物素
‑
抗体，形成(量子点
‑
亲和素
‑
生物素
‑
抗体)
‑
(量子点
‑
亲和素
‑
生物素
‑ꢀ
抗体)复合物，如此循环标记，达到荧光探针信号增强的目的。
[0028]为解决上述技术问题，本专利技术采用的第三个技术方案是：提供一种如上所述的制备 方法制得的信号放大量子点荧光免疫探针在荧光免疫检测中的应用。
[0029]本专利技术的有益效果是：
[0030](1)本专利技术在生物素与亲和素能够高亲和力结合的基础上，将生物素与亲和素逐 级叠加结合，不仅能提高探针的信号强度，同时也增加了探针的捕获能力，其灵敏度和 线性性能得到极大的提高，通过本专利技术所述方法制得的探针，荧光标记物和抗体充足， 结构稳定，用于免疫检测具有捕获能力强、灵敏度高和线性宽等特点；
[0031](2)本专利技术利用生物素和亲和素的高亲和力特性，以多次循环放大标记实现荧光 免疫探针的信号放大，基于该专利技术结合全自动免疫分析仪器，可开发出一种新模式的免 疫诊断试剂。
具体实施方式
[0032]下面对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本 领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0033]实施例1：胃泌素17(G
‑
17)量子点免疫荧光层析试剂盒的制备，包括以下步骤：
[0034](1)G
‑
17荧光探针的制备：
[0035]a.向10mg量子点微球加入1ml的吗啉乙磺酸缓冲液(0.05M pH 5.5),再加入N
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺和1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲胺丙基)碳二亚胺至终浓度为5mM，于室温避光 振荡30min，得到活化的量子点微球；
[0036]b.用50mM pH 6.5的磷酸缓冲液洗涤活化的量子点微球，取3mg的亲和素与其充 分混匀，于室温避光振荡2h，反应结束后加入终浓度为1％的酪蛋白和0.05％吐温20， 对其剩余的活性位点进行封闭，于室温避光振荡1h，完成后，用0.02M pH 7.4含1％BSA 的PBS缓冲液洗涤，并重悬得到3mg/ml量子点
‑
亲和素复合物，4℃待用；
[0037]c.将胃泌素17检测抗体3mg用0.1M pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液在在透析袋中透析12h；向透析过的胃泌素17检测抗体加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺生物素至终浓度0.12mg/ml 在室温下搅拌反应6h，再加入9.6ul 1M的氯化铵，并搅拌15min；在4℃用PBS透析 12h，移除游离的生物素，收集透析过的液体，得到1.5mg/ml的生物素化胃泌素17抗 体，4℃待用；
[0038]d.取步骤b溶液0.1ml和步骤c溶液0.2ml进行混合，于室温搅拌反应3h，得到 荧光探针；
[0039]e.取步骤b溶液0.1ml加入到步骤d中，再加入步骤c溶液0.2ml进行二次标记， 于室温搅拌反应3h，得到荧光探针；
[0040]f.取步骤b溶液0.1ml加入到步骤e中，再加入步骤c溶液0.2ml，进行三次标记， 于室温搅拌反应3h，得到信号加强的G
‑
17荧光探针。
[0041](2)标记垫制备：
[0042]用0.02M pH 7.4含1％BSA的PBS缓冲液将信号加强的荧光探针稀释10倍后按 5ul/cm的参数将其喷涂在玻璃纤维膜上，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时；
[0043](3)固定相制备：
[0044]将胃泌素17捕获抗体用包被缓冲液稀释至1.5mg/ml，质控抗体稀释至1.0mg/ml， 采用BIODOT公司的XYZ3060将其按1ul/cm的量包被在颇尔120硝酸纤维素膜的检 测区和质控区后，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时；其中所述包被缓冲液的组成为： 0.02M磷酸盐缓冲液+2％的海藻糖。
[0045](4)样品垫制备：
[0046]用处理缓冲液浸泡玻璃纤维膜0.5h后，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时，处理 缓冲液为0.02本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种信号放大量子点荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用缩合剂将羧基量子点荧光微球活化，加入亲和素、酪蛋白进行反应，形成量子点荧光微球
‑
亲和素复合物；(2)连接活化生物素和抗体，得到生物素化抗体；(3)将所述生物素化抗体和所述量子点荧光微球
‑
亲和素复合物混合进行一次反应；(4)向一次反应后的溶液中加入所述量子点荧光微球
‑
亲和素复合物，再加入所述生物素化抗体进行二次反应，多次循环标记，制得信号放大的量子点荧光免疫探针。2.根据权利要求1所述的信号放大量子点荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤包括：(101)向量子点溶液中加入缩合剂进行活化，混匀超声分散5—20s，振荡反应10—30min；(102)向步骤(101)得到的溶液中加入亲和素，偶联反应0.5—3h；(103)向步骤(102)得到的溶液中加入封闭液，常温反应0.5—2h；(104)将步骤(103)离心后的沉淀用保存液复溶，得到量子点
‑
亲和素复合物。3.根据权利要求2所述的信号放大量子点荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，所述缩合剂采用N
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羟基琥珀酰亚胺、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲胺丙基)碳二亚胺、NN

【专利技术属性】
技术研发人员：陈竹，吴才桂，陈一凡，陈永晨，张海龙，
申请(专利权)人：安徽惠邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：