一种目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法技术

本申请公开了一种目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法。本申请的目标区域捕获方法，包括根据目标区域核酸序列设计向导核酸序列，将向导核酸序列与CAS9酶组合，采用向导核酸序列与CAS9酶的复合物对待处理核酸样品进行酶切消化，根据片段大小回收获得目标区域。本申请的目标区域捕获方法，流程短、操作简单，节省了交付周期和人力成本；并且，捕获效率高，增加了有效数据利用率，节约测序成本。本申请利用CRISPR/Cas9系统进行目标区域捕获，整个捕获过程无需采用PCR扩增，能够保留目标区域基因的甲基化等原始修饰信息。的甲基化等原始修饰信息。的甲基化等原始修饰信息。

【技术实现步骤摘要】
一种目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法


[0001]本申请涉及目标区域捕获
，特别是涉及一种目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法。

技术介绍

[0002]目标区域测序(Target region sequencing)是通过定制感兴趣的基因组区域的探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。通过对大量样本的目标区域研究，有助于发现和验证疾病相关候选基因或相关位点，在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力。杂交捕获的原理是人为设计DNA或者RNA探针，探针可以和目标区段部分或者全部互补；将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃；之后通过变性，一般是调节pH值到碱性，将探针和捕获区段分开；被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。目标区域捕获适用于疾病的大样本量分析，包括帕金森、智力障碍、扩张型心肌病、乳腺癌等多种疾病的研究。
[0003]目标区域测序的目标区域捕获技术主要是，在溶液中，目标DNA片段和带有生物素标记探针直接杂交，然后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上；洗去非目标DNA，洗脱后，富集的DNA用于测序。现有的目标区域捕获技术，都是针对短读长测序的二代测序平台开发和设计。包括Pacbio官方和其他公司，在进行目标区域测序时，都是在二代测序的基础之上进行三代捕获测序技术的开发，由于方法的局限性，捕获效率极低，而且捕获到的基本都是短片段并没有充分利用第三代测序长读长的优点。
[0004]例如Pacbio的目标区域测序，其目标区域捕获建库测序技术包括，起始样品为人血液中提取得到的总DNA，G-tube打断后使用KAPA Hyper Prep Kits for Illumina sequencing试剂盒加接头，PCR扩增和富集总基因组DNA，使用IDT生物素标记的RNA探针捕获目的区域后，进行第二次PCR扩增富集目的区域，捕获PCR产物经损伤修复，末端修复，与已知接头SMRT-BELL连接，酶反应消化，BluePippin分选，最终得到哑铃形的文库，经过Agilent2100和Qubit HS检测合格后进行Pacbio上机测序，数据下机后进行CCS数据校正。整个流程详细如下：
[0005](1)设计探针，探针设计原则为：目的区域核酸序列，且与宿主基因组比对率低，长度为50nt的RNA类型IDT探针；
[0006](2)将基因组DNA打断至1-5kb；
[0007](3)用KAPA Hyper Prep Kits for Illumina sequencing试剂盒进行末端修复、加A、加Y字形接头，即pacbio核酸序列；
[0008](4)根据Y字形接头上的Primer，对基因组DNA进行PCR扩增；
[0009](5)样本混合pooling；
[0010](6)使用步骤(1)设计好的特定探针捕获捕获目标区域核酸序列；
[0011](7)M-270磁珠捕获目的区域；
[0012](8)PCR扩增富集捕获到的目标区域核酸序列；
[0013](9)损伤修复、末端修复、加SMRT-BELL接头、酶III酶VII消化，均使用Pacbio公布核酸序列；
[0014](10)制备上机：加primer、加测序聚合酶；
[0015](11)数据拆分：CCS校准。
[0016]以上在二代测序的基础之上开发的三代捕获测序技术，存在以下不足：
[0017]A、试验生产流程长，浪费人力物力成本较多；
[0018]B、建库过程中需要进行两次PCR扩增，然后上机测序，测序数据dup较高，造成较多的数据浪费；
[0019]C、由于建库过程中存在PCR过程，所以甲基化信息会在PCR过程中丢失，无法检测目标区域的甲基化修饰；
[0020]D、由于探针长度的限制，能够捕获的目的区域长度一般为1-5Kb，无法发挥第三代测序长读长的优点。

技术实现思路

[0021]本申请的目的是提供一种新的目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法。
[0022]本申请具体采用了以下技术方案：
[0023]本申请的第一方面公开了一种目标区域捕获方法，包括根据目标区域核酸序列设计向导核酸序列，将向导核酸序列与CAS9酶组合，采用向导核酸序列与CAS9酶的复合物对待处理核酸样品进行酶切消化，回收酶切消化产物中符合设计的酶切消化的目标区域核酸序列长度的核酸片段，即捕获得到目标区域。
[0024]需要说明的是，本申请的目标区域捕获方法，利用CRISPR/Cas9系统对目标区域进行酶切，获得预期大小的目标区域核酸片段，然后采用核酸片段分离的方法，获取目标区域。本申请的目标区域捕获方法，流程短，不仅节省了交付周期和人力成本；而且，提升了捕获效率，增加了有效数据的利用率，节约了测序成本；并且，本申请的捕获方法整个捕获过程中无需采用PCR扩增，可以保留基因组DNA原始修饰信息，直接检测目标区域甲基化等信息。
[0025]还需要说明的是，本申请的目标区域捕获方法，不仅适用于二代测序，更适用于第三代测序，打破了现有技术普遍在第二代测序的基础之上进行第三代测序目标区域捕获技术开发的技术限制，解决了针对目标区域的第三代测序受第二代测序捕获技术限制的技术问题。本申请的目标区域捕获方法，其捕获的目标区域产物可以用于任何测序或检测技术；例如，加入不同的测序接头就可以适用于不同的测序平台。
[0026]优选的，本申请的目标区域捕获方法中，向导核酸序列由crRNA引物与tracrRNA引物退火组装形成。
[0027]可以理解，在CRISPR/Cas9系统中，向导核酸序列是由设计的crRNA引物与通用的tracrRNA引物退火组装形成；其中，设计的crRNA引物即针对目标区域设计的精确靶向目标区域的寡核苷酸；而tracrRNA引物则是一段与设计的crRNA引物退火形成发夹结构的寡核苷酸核酸序列，crRNA引物与tracrRNA引物退火组装成向导核酸序列。
[0028]优选的，本申请的目标区域捕获方法，还包括对酶切消化产物进行磁珠纯化，然后再进行核酸片段筛选，捕获目标区域。
[0029]需要说明的是，磁珠纯化的目的是为了方便后续核酸片段筛选，可以理解，除了磁珠纯化以外，不排除还可以采用其它的核酸纯化方法。
[0030]优选的，本申请的目标区域捕获方法中，回收酶切消化产物中的核酸片段，具体采用Blue Pippin自动化核酸回收系统进行目标区域的核酸片段分选。
[0031]需要说明的是，Blue Pippin只是本申请的一种实现方式中具体采用的核酸回收系统，不排除还可以采用其它分离不同大小核酸片段的方法或系统。
[0032]本申请的第二方面公开了一种目标区域捕获试剂盒，包括针对目标区域核酸序列设计的crRNA引物和通用的tracrRNA引物。
[0033]需要说明的是，本申请的目标区域捕获方法，其关键在于针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种目标区域捕获方法，其特征在于：包括根据目标区域核酸序列设计向导核酸序列，将向导核酸序列与CAS9酶组合，采用向导核酸序列与CAS9酶的复合物对待处理核酸样品进行酶切消化，回收酶切消化产物中符合设计的酶切消化的目标区域核酸序列长度的核酸片段，即捕获得到所述目标区域。2.根据权利要求1所述的目标区域捕获方法，其特征在于：所述向导核酸序列由crRNA引物与tracrRNA引物退火组装形成。3.根据权利要求1所述的目标区域捕获方法，其特征在于：还包括对所述酶切消化产物进行磁珠纯化，然后再进行核酸片段筛选，捕获目标区域；优选的，回收酶切消化产物中的核酸片段，具体采用Blue Pippin自动化核酸回收系统进行目标区域的核酸片段分选。4.一种目标区域捕获试剂盒，其特征在于：包括针对目标区域核酸序列设计的crRNA引物和通用的tracrRNA引物。5.根据权利要求4所述的目标区域捕获试剂盒，其特征在于：还包括CAS9酶、crRNA引物与tracrRNA引物退火组装试剂、向导核酸序列与CAS9酶组合试剂、CAS9酶的酶切消化试剂和磁珠纯化试剂中的至少一种。6.一种测序方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的目标区域捕获方法或者权利要求4或5所述的目标区域捕获试...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄标，刘晨，刘群，周荣芳，丁斐，黄金，田志坚，
申请(专利权)人：武汉华大医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：