本发明专利技术公开了一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用，本发明专利技术所述测定方法包括下列步骤：（1）将待测样品进行ATP裂解释放；（2）在上述混合液中加入荧光检测液，混合均匀；（3）用荧光检测仪读取荧光值；（4）根据ATP标准品制作的标准曲线，获得微生物数量。本发明专利技术方法灵敏度高、成本低廉、操作简易，能够快速有效地测定口腔类微生物数量，可用于口腔清洁类产品抑菌效果评价和临床诊断等领域。产品抑菌效果评价和临床诊断等领域。
【技术实现步骤摘要】
一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用。
技术介绍
[0002]在人的口腔内繁殖有大量的微生物，其中可能包含诱发牙齿龋齿、牙龈炎和牙周炎或口腔炎的微生物。因此，口腔类微生物数量的测量对于口腔疾病的诊断、预后以及口腔清洁类产品抑菌效果的评价等具有重要意义。目前测量口腔类微生物数量的方法主要为微生物平板培养，虽然该方法灵敏度高，为微生物数量测定的“金标准”，但其存在操作复杂、所需时间长、不能测定无法培养微生物的数量等缺点。因此，寻找一种不依赖于培养的操作简易、灵敏度高的口腔类微生物数量的快速测定方法是相关领域技术人员亟待解决的问题。
[0003]ATP生物荧光检测是基于生物发光体系的发光机理所设计，生物体发光细胞内具有特殊的发光物质——荧光素及荧光素酶，荧光素在荧光素酶催化下，由三磷酸腺苷（ATP）激活发出荧光光子。由于所有生物活细胞中含有恒量的ATP，所以ATP含量可以清晰地表明样品中微生物与其他生物残余的多少。其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系。利用这一发光体系测定微生物释放出的ATP，可进行微生物含量的测定，为在数分钟内检测微生物提供了一种简便而灵敏的方法。目前，尚未见有将ATP生物荧光检测方法用于测定口腔类微生物数量的报道。
技术实现思路
[0004]本专利技术目的在于，一种口腔类微生物数量快速测定方法。以克服当前口腔微生物数量测定中所遇到的操作复杂、所需时间长、不能测定无法培养微生物的数量等问题。
[0005]本专利技术的再一目的在于：提供一种口腔类微生物数量快速测定试剂盒。
[0006]本专利技术的又一目的在于：提供一种口腔类微生物数量快速测定方法的应用，所述应用为口腔清洁类产品抑菌效果评价。
[0007]本专利技术目的通过下述方案实现：一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）将待测样品进行ATP裂解释放；（2）在上述混合液中加入荧光检测液，混合均匀；（3）用荧光检测仪读取荧光值；（4）根据ATP标准品制作的标准曲线，获得微生物数量。
[0008]本专利技术克服了当前口腔微生物数量测定中所遇到的操作复杂、所需时间长、不能测定无法培养微生物的数量等问题。基于口腔类微生物的特点，基于ATP生物荧光检测方法所提供的一种口腔类微生物数量测定方法具有操作简便、检测时间短，灵敏度高，降低了无法培养微生物的漏检率。
[0009]本专利技术所述的待测样品包括临床诊断样品、口腔类微生物的纯培养物中的一种或多种。所述的临床诊断样品包括拭子、唾液中的一种或多种。
[0010]本专利技术所述的ATP裂解释放的方法包括表面活性剂裂解释放、加热煮沸裂解释放、超声裂解释放、酸裂解释放、碱裂解释放等裂解释放方法中的一种。
[0011]本专利技术所述的荧光检测液包括荧光素、荧光素酶中的一种或多种。所述的荧光检测液是每60mL的ATP荧光试剂缓冲溶液包含32mg荧光素酶、25.2mg的D
‑
荧光素和112mg牛血清蛋白。其中，所述的ATP荧光试剂缓冲溶液是每1000mL水中溶解有4.468g三羟甲基氨基甲烷、0.732g乙二胺四乙酸二钠、3.232g乙酸镁、26.8mg二巯基苏糖醇、100g的β
‑
环糊精和3.7g葡萄糖。
[0012]本专利技术所述的荧光检测仪，包括生物化学发光检测仪、实时荧光检测仪、便携式荧光检测仪等。
[0013]本专利技术提供一种口腔类微生物数量快速测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表面活性剂、荧光素、荧光素酶、ATP标准品中的一种或多种。
[0014]本专利技术所述的表面活性剂，其特征在于，所述的表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、苯扎溴铵（BAB）、苯扎氯胺（BAC）、二羟基苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、三氯乙酸（TCA）等中的一种或多种。
[0015]本专利技术提供一种口腔类微生物数量快速测定方法的应用，其特征在于，所述应用为口腔清洁产品抑菌效果评价。
[0016]本专利技术所述的ATP标准品用于绘制标准曲线。在与ATP标准品实验条件一致的情况下，后续测试待测样品时，标准曲线的绘制非必需。
[0017]本专利技术为口腔清洁类产品和临床诊断等领域提供了一种口腔类微生物数量快速测定方法。本专利技术有益效果包括：采用本专利技术测定口腔类微生物数量的方法具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高等优点。与目前常用的微生物培养法相比，本专利技术采用的基于ATP生物荧光检测原理，不需要进行微生物培养，避免了繁琐的培养基制备、涂板和菌落计数等步骤，因而，非常适于口腔清洁类产品抑菌效果评价和临床诊断。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本专利技术保护范围。
具体实施方式
[0018]结合以下具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0019]实施例1绘制ATP标准品标准曲线的方法，按下述步骤：取ATP标准品（0.5mmol/L），在ATP标准品内加入400μL冰浴无菌生理盐水轻轻振动混匀，制得10
‑4mol/L的ATP标准品稀释液，然后，依次进行10倍稀释，获得10
‑5～10
‑
10
mol/L的标准品系列稀释液；各浓度梯度ATP标准品分别与0.03% CTAB按体积比10:1轻轻振动混匀，4
o
C离心机，10000g离心5分钟，进行ATP裂解释放；
将20μL梯度ATP稀释液加入100μL自行配制的荧光检测液，混合均匀，反应3分钟；所述的荧光检测液是每60mL的ATP荧光试剂缓冲溶液包含32mg荧光素酶、25.2mg的D
‑
荧光素和112mg牛血清蛋白，其中，所述的ATP荧光试剂缓冲溶液是每1000mL水中溶解有4.468g三羟甲基氨基甲烷、0.732g乙二胺四乙酸二钠、3.232g乙酸镁、26.8mg二巯基苏糖醇、100g的β
‑
环糊精和3.7g葡萄糖；用荧光检测仪读取荧光值；各个稀释梯度依次检测三个平行样品并求取平均值，以ATP标准品浓度对数值为横坐标，以对应荧光强度的对数值为纵坐标，绘制ATP标准品的标准曲线。
[0020]通过回归分析，得到一元线性方程为y=0.8546x+9.843（R2=0.9965，P<0.05）,表明由ATP标准品制作的标准曲线具有代表性。
[0021]实施例2口腔类细菌数量的快速测定方法：1，金黄色葡萄球菌是口腔颌面部多间隙感染的一种重要病原菌，本实施例实验所用的金黄色葡萄球菌菌株购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CIC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种口腔类微生物数量快速测定方法，采用ATP标准品制作标准曲线，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）将待测样品进行ATP裂解释放；（2）在上述混合液中加入荧光检测液，混合均匀；（3）用荧光检测仪读取荧光值；（4）根据ATP标准品制作的标准曲线，获得微生物数量。2.如权利要求1所述的一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，所述的待测样品包括临床诊断样品、口腔类微生物的纯培养物，其中，所述的临床诊断样品包括拭子、唾液中的一种或多种。3.如权利要求1所述的一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，所述的ATP裂解释放的方法包括表面活性剂裂解释放、加热煮沸裂解释放、超声裂解释放、酸裂解释放或碱裂解释放方法中的一种，其中，所述的表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、苯扎溴铵、苯扎氯胺、二羟基苏糖醇、十二烷基硫酸钠、三氯乙酸等中的一种或多种。4.如权利要求1所述的一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，所述的荧光检测液是每60mL的ATP荧光试剂缓冲溶液包含32mg荧光素酶、25.2mg的D
‑
荧光素和112mg牛血清蛋白，其中，所述的ATP荧光试剂缓冲溶液是每1000mL水中溶解有4.468g三羟甲基氨基甲烷、0.732g乙二胺四乙酸二钠、3.232g乙酸镁、26.8mg二巯基苏糖醇、100g的β
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环糊精和3.7g葡萄糖。5.如权利要求1所述的一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，所述的荧光检测仪，包括生物化学发光检测仪、实时荧光检测仪、便携式荧光检测仪中的一种或多种。6.如权利要求1所述的一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，绘制ATP标准品标准曲线按下述步骤：1）取0.5mmol/L的 ATP标准品，加入400μL冰浴无菌生理盐水轻轻振动混匀，制得10
‑4mol/L的ATP标准品稀释液；然后，2）依次进行10倍稀释，获得10
‑5～10
‑
10
mol/L的标准品系列稀释液；3）各浓度梯度ATP标准品稀释液分别与0.03% CTAB按体积比10:1轻轻振动混匀，4
o
C离心机，100...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，李雪玲，梁辉，田静，吕军鸿，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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