羟甲基化分析中DNA整体转化效率的评估方法技术

本发明专利技术提供一种羟甲基化分析中DNA整体转化效率的评估方法。在羟甲基化检测分析中，DNA转化效率的检测至关重要，但由于当前转化效率检测技术的应用限制及转化效率不佳带来的一系列问题，急需一种快速、准确且低成本的适用于测序前对DNA转化效率进行检测的方法。本发明专利技术提供了一种用于评估羟甲基化分析中DNA整体转化效率的外源参照核酸片段组合物，通过一个修饰位点的转化效率即可反应片段的整体转化效率，再结合SNaPshot方法，通过延伸位点碱基峰的峰高比估算DNA整体转化效率。本申请的评估方法快速准确、具有普适性且成本低廉，将该方法用于二代测序之前，对转化效率进行质控，提高DNA羟甲基化分析准确性和高效性。提高DNA羟甲基化分析准确性和高效性。

【技术实现步骤摘要】
羟甲基化分析中DNA整体转化效率的评估方法


[0001]本专利技术具体涉及羟甲基化分析中DNA整体转化效率的评估方法。

技术介绍

[0002]DNA羟甲基化修饰(5
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hydroxymethylcytosine,5hmC)作为一种新的修饰形式，其化学本质是在DNA甲基化(5
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methylcytosine,5mC)的基础上，胞嘧啶第五位碳原子的甲基基团上增加一个羟基基团。羟甲基化修饰不仅参与了DNA去甲基化过程，而且在胚胎发育、细胞分化及基因转录与表达调控等过程中发挥重要作用，此外，5hmC还可能与特定的肿瘤发生密切相关，或可成为某些肿瘤早期诊断的分子标志物。因其重要的生物学功能，5hmC修饰日益得到关注，相关的检测方法也得到极大发展。其中，APOBEC
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偶联表观遗传测序(APOBEC
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coupled epigenetic sequencing)(Schutsky,E.K.,DeNizio,J.E.,Hu,P.,Liu,M.Y.,Nabel,C.S.,Fabyanic,E.B.,...Kohli,R.M.(2018).Nondestructive,base
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resolution sequencing of 5
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hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase.Nat Biotechnol.doi:10.1038/nbt.4204)作为近年来的新技术，具有微量，灵敏度高，对DNA损伤较小，直接检测5hmC的特点，受到广泛关注与应用。
[0003]APOBEC
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偶联表观遗传测序是一种基于APOBEC(apolipoprotein B mRNA editing catalyzed polypeptide)酶学转化的DNA羟甲基化水平检测方法，该方法首先使用β
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GT(β
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glucosyltransferase)对羟甲基化5hmC进行保护，后使用APOBEC脱氨酶处理，使甲基化5mC及未甲基化C碱基分别转化为胸腺嘧啶T和尿嘧啶U碱基，而经保护的5hmC不受影响，经文库构建及测序后，甲基化5mC与未甲基化C碱基测序结果为T碱基，而5hmC测序结果保持为C碱基，从而实现对DNA羟甲基化位点的直接检测。可见，5mC及未甲基化C转化为T或U以及5hmC未转化(被保护)的效率，直接决定了该方法对DNA羟甲基化检测的准确性，若样本中5mC及C碱基转化效率过低，会造成检测结果的假阳性；若样本中5hmC被保护效率过低，即5hmC
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T转化效率过高，会导致无法检测到真实的羟甲基化修饰，产生假阴性结果；因此，在该DNA羟甲基化检测方法中，对DNA甲基化5mC、未甲基化C及羟甲基化5hmC转化效率的检测非常必要。
[0004]通过添加外源Spike in control序列，用于评估甲基化5mC、未甲基化C及羟甲基化5hmC的转化效率是一种经典且有效的转化效率评估方法。APOBEC
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偶联表观遗传测序实验中，因APOBEC脱氨酶存在位点偏好性，极少部分区域的5mC碱基，转化效率远低于整体水平，显然，用于评估5mC
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T转化效率的Spike in control序列需包含特殊的转化效率较差的位点，以能够真实反映转化效率的问题。另一方面，因APOBEC脱氨酶对未甲基化C的脱氨作用优于甲基化5mC，因此，对5mC
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T转化效率的评估即可反映出未甲基化C
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U的转化效率，在二代测序前对转化效率质控时，不需额外对C
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U的转化效率进行评估。
[0005]目前对DNA转化效率的评估，主要包括以下方法：1)一代测序方法。Sanger测序虽成本低，但需要进行PCR扩增、克隆至载体等步骤，较为繁琐，准确性欠佳。2)二代测序方法。二代测序通量高、准确性好，但由于建库上机及分析流程的问题，周期较长。3)荧光定量方法。该方法操作时间短，但需额外设置标准品曲线以直观展示羟甲基化水平，并且方法的分
辨率有限。
[0006]因此，在后续二代测序前，迫切需要一种简单快速、具有普适性且成本低廉的检测方法，对转化效率进行质控，以避免测序后才发现问题造成的试剂，人力以及时间的浪费。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种能够准确评估羟甲基化分析中DNA整体转化效率的外源参照核酸片段组合物，以及在羟甲基化分析中能够快速且准确地进行DNA整体转化效率评估的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面提供一种用于评估羟甲基化分析中DNA整体转化效率的外源参照核酸片段组合物，所述的外源参照核酸片段组合物包括用于评估DNA整体甲基化转化效率的第一核酸片段，所述的第一核酸片段具有如SEQ ID NO.1所示的序列，所述的第一核酸片段46位点或52位点具有甲基化修饰。
[0010]优选地，所述的第一核酸片段的22位点、37位点、39位点、46位点、48位点、52位点、53位点、60位点、64位点、67位点、72～74位点、76位点、77位点、94位点、95位点、98～100位点、113位点、119位点、120位点、124位点、126位点、129位点、131位点、133位点、143位点、146位点、151位点、152位点、154位点、158位点、160位点、166位点、168位点、170位点、171位点、174位点、178位点、180位点、181位点、185位点、186位点、189位点、192位点、193位点、195位点、203位点中的一个或多个具有甲基化修饰。
[0011]根据一种具体且优选地实施方式，所述的第一核酸片段的22位点、37位点、39位点、46位点、48位点、52位点、53位点、60位点、64位点、67位点、72～74位点、76位点、77位点、94位点、95位点、98～100位点、113位点、119位点、120位点、124位点、126位点、129位点、131位点、133位点、143位点、146位点、151位点、152位点、154位点、158位点、160位点、166位点、168位点、170位点、171位点、174位点、178位点、180位点、181位点、185位点、186位点、189位点、192位点、193位点、195位点、203位点具有甲基化修饰。
[0012]优选地，所述的外源参照核酸片段组合物还包括用于评估DNA整体羟甲基化转化效率的第二核酸片段，所述的第二核酸片段具有如SEQ ID NO.2所示的序列，所述的第二核酸片段的46位点、49位点、53位点、59位点、60～62位点、70位点、75～79位点、87位点、92～95位点、97位点、103位点、106位点、112位点、115位点、119位点、121位点、125位点、126位点、128～130位点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于评估羟甲基化分析中DNA整体转化效率的外源参照核酸片段组合物，其特征在于，所述的外源参照核酸片段组合物包括用于评估DNA整体甲基化转化效率的第一核酸片段，所述的第一核酸片段具有如SEQ ID NO.1所示的序列，所述的第一核酸片段46位点或52位点具有甲基化修饰。2.根据权利要求1所述的用于评估羟甲基化分析中DNA整体转化效率的外源参照核酸片段组合物，其特征在于，所述的第一核酸片段的22位点、37位点、39位点、46位点、48位点、52位点、53位点、60位点、64位点、67位点、72～74位点、76位点、77位点、94位点、95位点、98～100位点、113位点、119位点、120位点、124位点、126位点、129位点、131位点、133位点、143位点、146位点、151位点、152位点、154位点、158位点、160位点、166位点、168位点、170位点、171位点、174位点、178位点、180位点、181位点、185位点、186位点、189位点、192位点、193位点、195位点、203位点中一个或多个位点具有甲基化修饰。3.根据权利要求1所述的外源参照核酸片段组合物，其特征在于：所述的外源参照核酸片段组合物还包括用于评估DNA整体羟甲基化转化效率的第二核酸片段，所述的第二核酸片段具有如SEQ ID NO.2所示的序列，所述的第二核酸片段的46位点、49位点、53位点、59位点、60～62位点、70位点、75～79位点、87位点、92～95位点、97位点、103位点、106位点、112位点、115位点、119位点、121位点、125位点、126位点、128～130位点、132位点、134位点、136位点、137位点、140位点、142位点、143位点、146位点、148位点、150位点、153位点、156位点、168位点、169位点、174位点、180位点、189位点中至少一个位点具有羟甲基化修饰。4.一种用于评估羟甲基化分析中DNA整体转化效率的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1至3中任一项所述的外源参照核酸片段组合物。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于保护羟甲基化修饰位点的糖基化转移酶；用于未甲基化及甲基化修饰位点转化处理的APOBEC脱氨酶；用于扩增转化后的第一核酸片段和转化后的第二核酸片段的扩增反应试剂，所述的扩增反应试剂包括用于扩增转化后的第一核酸片段的第一引物对和用于扩增转化后的第二核酸片段的第二引物对。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括SNaPshot检测试剂，所述的SNaPshot检测试剂包括：用于转化后的第一核酸片段的扩增产物的单碱基延伸反应的第一单碱基延伸反应引物，所述的第一核酸片段的扩增产物的单碱基延伸反应的延伸位点为选定甲基化修饰位点；用于转化后的第二核酸片段的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜正文，王果，方欧，
申请(专利权)人：上海天昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：