【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因编辑中非预期突变的抑制
技术介绍
[0001]基因组编辑是一种基因工程,利用工程核酸酶(分子剪刀)将DNA插入、删除或替换到活生物体的基因组中。利用基因组编辑工具对细胞和活生物体的基因组进行遗传操作在生命科学研究、生物技术/农业技术开发以及最重要的药物/临床创新中有着广泛的应用。例如,基因组编辑可用于纠正遗传疾病背后的驱动突变,从而彻底治愈活生物体中的这些疾病。基因组编辑还可用于工程改造农作物基因组,提高农作物产量,赋予农作物抗环境污染或病原体感染的能力。此外,通过精确的基因组编辑进行微生物基因组转化对可再生生物能源的开发具有重要意义。
[0002]CRISPR/Cas(成簇的规则间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白)系统因其无与伦比的编辑效率、便捷性和在活生物体中的潜在应用,自诞生以来一直是最强大的基因组编辑工具。在引导RNA(gRNA)的引导下,Cas核酸酶可以在各种细胞(细胞系和来自活生物体的细胞)的靶基因组位点产生DNA双链断裂(DSBs)。这些DSBs随后被内源性DNA修复系统修复,可用于进行所需的基因组编辑。
[0003]一般而言,DSBs可激活两种主要的DNA修复途径:非同源末端连接(NHEJ)和同源导向修复(HDR)。NHEJ可在DSBs周围的基因组DNA区域引入随机插入/缺失(indels),导致开放阅读框(ORF)移位,最终导致基因失活。相反,当HDR被触发时,靶位点的基因组DNA序列可以通过同源重组机制被外源供体DNA模板的序列替代,从而导致遗传突变的纠正。然而,HDR介导的基因纠正的实际效率较 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白,其包括:含有核碱基脱氨酶或其催化结构域的第一片段,含有核碱基脱氨酶抑制剂的第二片段,以及第一片段和第二片段之间的蛋白酶切割位点。2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶为腺苷脱氨酶。3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其中所述腺苷脱氨酶选自由tRNA特异性腺苷脱氨酶(TadA)、tRNA特异性腺苷脱氨酶1(ADAT1)、tRNA特异性腺苷脱氨酶2(ADAT2)、tRNA特异性腺苷脱氨酶3(ADAT3)、RNA特异性腺苷脱氨酶B1(ADARB1)、RNA特异性腺苷脱氨酶B2(ADARB2)、腺苷一磷酸脱氨酶1(AMPD1)、腺苷一磷酸脱氨酶2(AMPD2)、腺苷一磷酸脱氨酶3(AMPD3)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷脱氨酶2(ADA2)、腺苷脱氨酶类似物(ADAL)、含腺苷脱氨酶结构域1(ADAD1)、含腺苷脱氨酶结构域2(ADAD2)、RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)和RNA特异性腺苷脱氨酶B1(ADARB1)组成的组。4.根据权利要求1所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶为胞苷脱氨酶。5.根据权利要求4所述的融合蛋白,其中所述胞苷脱氨酶选自由APOBEC3B(A3B)、APOBEC3C(A3C)、APOBEC3D(A3D)、APOBEC3F(A3F)、APOBEC3G(A3G)、APOBEC3H(A3H)、APOBEC1(A1)、APOBEC3(A3)、APOBEC2(A2)、APOBEC4(A4)和AICDA(AID)组成的组。6.根据权利要求4所述的融合蛋白,其中所述胞苷脱氨酶为人或小鼠胞苷脱氨酶。7.根据权利要求6所述的融合蛋白,其中所述催化结构域为小鼠A3胞苷脱氨酶结构域1(CDA1)或人A3B胞苷脱氨酶结构域2(CDA2)。8.根据权利要求1
‑
7中任一所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶抑制剂为核碱基脱氨酶的抑制结构域。9.根据权利要求8所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶抑制剂为胞苷脱氨酶的抑制结构域。10.根据权利要求9所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶抑制剂包含选自如SEQ ID NO:1
‑
2和48
‑
135所示的氨基酸序列,或与选自如SEQ ID NO:1
‑
2和48
‑
135所示的氨基酸序列中的任一具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。11.根据权利要求9所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶抑制剂包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸残基AA128
‑
AA223或如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。12.根据权利要求1
‑
11中任一所述的融合蛋白,其中所述第一片段还包含成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的(Cas)蛋白。13.根据权利要求12所述的融合蛋白,其中所述Cas蛋白选自由SpCas 9、FnCas 9、St1Cas9、St3Cas9、NmCas9、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VOR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9、SpCas9
‑
NG、xSpCas9、RHA FnCas9、KKH SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、BhCas12b、AkCas12b、EbCas12b、LsCas12b、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b和RanCas13b组成的组。14.根据权利要求1
‑
13中任一所述的融合蛋白,其中所述蛋白酶切割位点选自由TuMV蛋白酶、PPV蛋白酶、PVY蛋白酶、ZIKV蛋白酶和WNV蛋白酶组成的组。
15.根据权利要求1
‑
13中任一所述的融合蛋白,其中所述蛋白酶切割位点为自切割位点。16.根据权利要求1
‑
13中任一所述的融合蛋白,其中所述蛋白酶切割位点为TEV蛋白酶切割位点。17.根据权利要求16所述的融合蛋白,还包括含有TEV蛋白酶的第三片段或其一片段。18.根据权利要求17所述的融合蛋白,其中所述第三片段包含单独不能切割所述TEV蛋白酶切割位点的TEV蛋白酶片段。19.一种融合蛋白,其包括:第一片段,其包含核碱基脱氨酶或其催化结构域、成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的(Cas)蛋白和第一TEV蛋白酶片段,第二片段,其包含核碱基脱氨酶抑制剂,和第一片段和第二片段之间的TEV蛋白酶切割位点,其中第一TEV蛋白酶片段单独不能切割TEV蛋白酶切割位点。20.根据权利要求19所述的融合蛋白,其还包含尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。21.根据权利要求19所述的融合蛋白,其中所述的核碱基脱氨酶抑制剂、所述的TEV蛋白酶切割位点、所述的核碱基脱氨酶或其催化结构域、所述Cas蛋白和所述的第一TEV蛋白酶片段从N
‑
末端排列至C
‑
末端。22.根据权利要求19所述的融合蛋白,其中所述第一TEV蛋白酶片段为所述TEV蛋白酶的N
‑
末端结构域(SEQ ID NO:3)或C
‑
末端结构域(SEQ ID NO:4)。23.根据权利要求22所述的融合蛋白,其中所述TEV蛋白酶切割位点具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。24.根据权利要求19所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶选自由APOBEC3B(A3B)、APOBEC3C(A3C)、APOBEC3D(A3D)、APOBEC3F(A3F)、APOBEC3G(A3G)、APOBEC3H(A3H)、APOBEC1(A1)、APOBEC3(A3)、APOBEC2(A2)、APOBEC4(A4)和AICDA(AID)组成的组。25.根据权利要求19所述的融合蛋白,其中所述核碱基脱氨酶抑制剂包含选自如SEQ ID NO:1
‑
2和48
‑
135所示的氨基酸序列,或与选自如SEQ ID NO:1
‑
2和48
‑
135所示的氨基酸序列中的任一具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。26.根据权利要求19所述的融合蛋白,其中所述Cas蛋白选自由SpCas9、FnCas 9、St1Cas9、St3Cas9、NmCas9、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VOR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9、SpCas9
‑
NG、xSpCas9、RHA FnCas9、KKH SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、BhCas12b、AkCas12b、EbCas12b、LsCas12b、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b和RanCas13b组成的组。27.一种在细胞中的靶位点进行遗传编辑的方法,包括向细胞导入:(a)权利要求19
‑
26任一项的融合蛋白,(b)靶向所述靶位点的引导RNA或靶向所述靶位点的crRNA和tracrRNA,并且还包含一个标签序列,和(c)与能够结合所述标签序列的RNA识别肽偶联的第二TEV蛋白酶片段。28.根据权利要求27所述的方法,其中通过编码所述分子的多核苷酸将一种或多种所
述分子引入所述细胞。29.根据权利要求27所述的方法,其中所述第一TEV蛋白酶片段和所述第二TEV蛋白酶片段在相互作用时能够切割所述TEV蛋白酶切割位点。30.根据权利要求27所述的方法,其中所述第二TEV蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员:陈佳,杨贝,杨力,黄行许,王丽洁,
申请(专利权)人:上海科技大学,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。