多重氨基酸定量方法及试剂盒研制技术

本发明专利技术涉及了一种新的多重氨基酸定量方法（multiple amino acid quantification，MAAQ）及相关试剂盒。本发明专利技术的技术方案为：利用甲醛和氰基硼氢化钠及其各自的同位素形式进行有机组合，对氨基酸进行化学标记，使得氨基酸带上不同的质量标签，利用选择离子扫描（selective ion monitoring,SIM）、多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）、平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）或非数据依赖采集（data independent acquisition,DIA）实现多个样品中氨基酸定量分析。该方法及试剂盒具有定量通量高、成本低、精准度高等优点，利用该试剂盒可以大大方便氨基酸的定量。基酸的定量。基酸的定量。

【技术实现步骤摘要】
多重氨基酸定量方法及试剂盒研制


[0001]本专利技术设计了一种基于质谱技术的氨基酸定量法，可实现氨基酸样品大规模、高准确度和高精密度定量，此外该方法还有其他优点如价格低廉、方法标记简单、标记效率高、无副反应等。该方法可以用于临床诊断、食品样品所含有的氨基酸的定量分析。

技术介绍

[0002]氨基酸是生命的重要组成部分，是蛋白质的组成单元。人体内重要的氨基酸有40余种，包括20种蛋白质氨基酸以及一些有重要功能的氨基酸，统称为“全谱氨基酸”。具体包含精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、γ
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氨基丁酸、甘氨酸、丝氨酸、牛磺酸、酪氨酸、α
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氨基已二酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸、α
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氨基正丁酸、丙氨酸、鹅肌肽、β
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丙氨酸、β
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氨基异丁酸、肌肽、乙醇胺、δ
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羟基赖氨酸、羟化脯氨酸、1
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甲基组氨酸、3
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甲基组氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、脯氨酸、肌氨酸、精氨琥珀酸、羟化瓜氨酸。全谱氨基酸与诸多疾病相关，设计代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统等疾病，也与儿童骨骼发育、激素分泌等相关。除此以外，食品检测中也需要测试氨基酸的含量以确定食品的功效。
[0003]现有的定量方法主要是衍生法结合液相色谱法、气相色谱
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质谱法以及液相色谱质谱联用方法。液相色谱
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质谱联用方法因样品处理简单，可以同时实现定性定量，得到了更为广泛的应用。液相色谱
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质谱方法的应用均基于稳定同位素标记加入法，稳定同位素的引入既可以通过在样品预处理过程中加入含有13C、15N或者2H元素的氨基酸，以及使用含有这些元素的试剂进行化学标记。然而上述方法检测的成本高、通量低，限制了该方法在临床上的使用。

技术实现思路

[0004]为此，我们设计了新型标记方法，利用甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，如表1所示，实现了最高八重样品的同时定量分析，单个样品的分析成本不足现有分析方法的1/10。
[0005]表1含有不同同位素标记的甲醛与氰基硼氢化钠组合标记汇总
[0006][0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]1.内标氨基酸的制备：用8种标记组合任何一种标记标准氨基酸作为内标氨基酸使用，本试剂盒选择Dim36标记标准氨基酸。
[0009]2.质控品的制备：用不同于内标氨基酸的标记试剂标记标准氨基酸，加入到血清干粉中。本试剂盒选择使用Dim28标记标准氨基酸，加入内标氨基酸。
[0010]3.校准品制备：选择Dim28，Dim30H，Dim32H，Dim34H和Dim36分别标记标准氨基酸，并以一定的浓度梯度混合到一起加入到血清干粉中。
[0011]4.临床样品氨基酸提取：静脉取血，离心去除血细胞，收集上清。向上清里加入乙腈或甲醇沉淀蛋白，离心取上清，吹干后，复溶并加入标记试剂，使游离氨基酸反应上化学标签。该标记试剂不能与内标氨基酸一样。
[0012]5.质控品和校准品复溶。加入含乙腈或甲醇，沉淀蛋白，取上清。
[0013]6.质谱分析：将质控品、校准品的上清用氮气吹干，用色谱的流动相A液进行复溶。临床样品，质控品和校准品分别进行质谱分析。
[0014]本专利技术具有如下优点：
[0015]1.样品预处理简单，该方法的样品预处理过程与常规的样品预处理过程相同。
[0016]2.标记方法简单、高效、快速而且反应效果高，无副反应，该方法可以在5分钟以内完成样品的标记，标记效率100％。
[0017]3.该标记方法标记样品成本低，100μmol的氨基酸样品标记价格低，远低于iTRAQ 试剂和直接使用稳定同位素标记的氨基酸的价格。
附图说明：
[0018]1.图1为氨基酸经使用不同同位素组成的甲醛和氰基硼氢化钠标记后的产物及质量增加值的示意图。
具体实施方式
[0019]1.内标氨基酸的制备：将10μL 4％
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CD2O和10μL 0.6mol/L NaCNBD3的标记试剂加入到100μL 0.01M酪氨酸水溶液中，室温反应15min，随后加入10μL 1M NH4HCO3溶液，反应10min以去除多余的标记试剂。上述反应完的溶液作为内标储备液，用0.1％甲酸将工作液稀释1000倍用作工作液。
[0020]2.质控品的制备：将10μL 4％CH2O和10μL 0.6mol/L NaCNBH3的标记试剂加入到100μL 0.01M酪氨酸水溶液中，室温反应15min，随后加入10μL 1M NH4HCO3溶液，反应10min以去除多余的标记试剂，用0.1％甲酸将工作液稀释500倍，取10μL加入到血清干粉。取10μL内标工作液加入到血清干粉中，用0.1mL 0.1％甲酸将血清干粉溶解，加入400μL乙腈沉淀蛋白，15000g离心，去除蛋白，收集上清，氮气吹干，用100μL 0.1％甲酸复溶待用。
[0021]3.校准品制备：以相同的方法，用Dim28，Dim30H，Dim32H，Dim34H和Dim36试剂分别标记酪氨酸溶液。并以Dim28：Dim30H：Dim32H：Dim34H：Dim36＝2:10:50:250:500混合后，加入到100μL的血清溶液中，加入400μL乙腈沉淀蛋白，15000g离心，去除蛋白，收集上清，氮气吹干，用100μL 0.1％甲酸复溶待用。
[0022]4.临床样品氨基酸提取：静脉取到的血，离心去除血细胞，收集上清。取100μL上清，加入400μL乙腈沉淀蛋白，15000g离心10min，取上清，加入10μL 4％CH2O和 10μL 0.6mol/L NaCNBH3，室温反应15min，随后加入10μL 1M NH4HCO3溶液，反应10min 以去除多余的标记试剂，加入10μL内标工作液，除盐吹干，用100μL流动相A液复溶，待用。
[0023]5.质谱分析：临床样品，质控品和校准品分别进行质谱分析。液相色谱条件：带柱温箱(CH
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A)的ACQUITY UPLC I
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Class，进样量1μL，柱温：40℃；色谱柱ACQUITY UPLCR BEH C18,1.7μm,2.1
×
100mm，流速0.2mL/min，流动相A：water+0.1％FA；流动相B： Meoh+0.1％FA+2mM ammonium formate。梯度表：
[0024]Time％B曲线0262263.510648064.3264.526
[0025]质谱条件：Xevo TQD；采集模式MRM，母离子210>164；212>166；214>168；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多重氨基酸定量方法(multiple amino acid quantification,MAAQ)，该方法利用甲醛和氰基硼氢化钠及其各自的同位素形式进行有机组合，对氨基酸进行化学标记，使待测氨基酸带上不同的质量标签，利用质谱的一级谱或二级谱的峰强度进行定量分析，将实验中流程固定化以及将所需要的试剂和耗材组装成试剂盒以便于方法的推广使用。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，对肽段进行标记，是指四种甲醛(CH2O，
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CH2O，CD2O和
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CD2O)和两种氰基硼氢化钠(NaCNBH3和NaCNBD3)进行组合，形成8种标记，产生不同的质量标签，如下表所示。3.根据权利要求1所述的方法，氨基酸的特征在于：生物体内的全谱氨基酸，具体有：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、γ
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氨基丁酸、甘氨酸、丝氨酸、牛磺酸、酪氨酸、α
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氨基已二酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸、α
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氨基正丁酸、丙氨酸、鹅肌肽、β
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丙氨酸、β
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氨基异丁酸、肌肽、乙醇胺、δ
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羟基赖氨酸、羟化脯氨酸、1
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甲基组氨酸、3
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甲基组氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、脯氨酸、肌氨酸、精氨琥珀酸、羟化瓜氨酸。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：质谱采集方法主要使用的质谱为三重四级杆质谱、四极杆
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飞行时间质谱和四极杆
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静电轨道阱质谱，质谱采集方法为多反应监测(MRM)、平行反应监测(PRM)、选择离子检测(SIM)和全扫描(full scan)。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：周愿，洪聪聪，田璐，吴祥佳，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：